【立论依据】 CVB3属于小RNA病毒科肠道病毒属,能引起包括病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎等多种严重的疾病;目前,CVB3感染引起病毒性心肌病我们尚无特效药物用于临床治疗,也没有合适的疫苗用于预防。3A是CVB3主要的非结构蛋白,参与形成病毒复制复合体的骨架蛋白及抑制内质网至高尔基体的物质转运,但其如何与宿主细胞内蛋白相互作用以及对宿主的致病机制仍不清楚。本课题的前期工作中,以CVB3病毒3A为诱饵、运用酵母双杂交系统从人心脏cDNA文库中筛出了多个阳性克隆,TMED4是7个阳性蛋白之一。相关文献报道,TMED4在细胞的凋亡中起促进作用,而TMED4表达的沉默,不仅可以促进HSP70的表达,也提高了HSP70和Apaf-1的结合能力,从而对细胞的凋亡起到了抑制作用。 【设计思路】 3A是否在细胞凋亡中有作用;进一步论证3A与TMED4存在相互作用;是否是3A和TMED4的相互作用影响了细胞凋亡。 【实验内容】 Annexin V法分别检测pBudCE4.1-3A+brefeldin A、pBudCE4.1+brefeldin A比较两组细胞的凋亡情况;COIP、激光共聚焦显微镜观察进一步论证3A与TMED4存在相互作用及共定位;动物感染CVB3后蛋白质印迹法检测TMED4的表达;Annexin V法及蛋白质印迹等实验分别对pBudCE4.1-3A+shTMED4、pBudCE4.1-3A+Cont.shRNA两组细胞的凋亡情况和HSP70、caspase-3的表达情况进行检测和分析。Annexin V法及蛋白质印迹等实验中每一实验组及对照组均采取多组平行实验分别按0、6、12、18、24、30、36、42 h等不同时间进行相关实验操作。 【材料】 成年BALB/c小鼠,TurboFect,brefeldin A,TMED4 Antibody,HSP70 Antibody,caspase-3 Antiboody,TMED4 shRNA Plasmid等。 【可行性】 本课题理论依据充足可行;课题所采用的各项技术已较熟练的掌握;课题所需器材完备,资金充足。 【创新性】 本课题的前期研究基础具有原创性且实验设计方案均为本组成员独立完成;TMED4是一个新发现且研究尚不足的蛋白,我们的研究成果必然会丰富TMED4在细胞内的功能且关于CVB3 3A与TMED4的相互作用对细胞结构和功能影响机制的研究在国际上属于首次。