【立论依据】 晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可通过[Ca²⁺]通道诱导细胞凋亡,而AGEs是否也能通过该通道诱导内皮细胞通透性增高尚不清楚,若我们能够证实,将对于糖尿病防治及其并发症的控制具有重大指导意义。 【设计思路】 用EGTA抑制外钙内流,研究[Ca²⁺]在AGEs介导的肌动蛋白骨架的改变,通透性的增高以及moesin磷酸化中所起的作用。 【实验内容】 探讨AGEs介导肌动蛋白丝F-actin改变的剂量和时间效应;证实 EGTA对AGEs介导内皮细胞骨架肌动蛋白改变的抑制作用;探讨AGEs引起内皮细胞通透性增高的时间和剂量效应;证实AGEs介导内皮细胞通透性的改变是[Ca²⁺]依赖性的;探讨AGEs引起moesin蛋白磷酸化的时间和剂量效应;验证AGEs引起moesin蛋白磷酸化是[Ca²⁺]依赖性的。 【材料】 激光共聚焦显微镜,跨上皮细胞电阻检测仪,倒置显微镜,垂直电泳仪,Transwell培养皿,低温离心机,Petri Dish培养皿,HUVECS细胞株,胰蛋白酶,Moesin抗体及磷酸化Moesin抗体,罗丹明-鬼笔环肽,胎牛血清,磷酸盐缓冲液,0.5% TritonX-100,4%多聚甲醛固定液,FITC标记的右旋糖干,EGTA标准溶液,细胞裂解液,封闭缓冲液,Tris盐缓冲液,TBST缓冲液,电泳加样缓冲液,Tris溶液。 【可行性】 本项目假设有类似文献支持,有一定的理论基础。本研究团队近年来一直在休克微循环实验室从事AGEs和内皮细胞通透性方面的工作。经过多次试验,已掌握一定的技术手段和研究数据。我们的预实验结果已经显示AGEs刺激脐静脉内皮细胞呈浓度和时间效应,且EGTA能有效地抑制了AGEs在第8小时诱导的通透性的增高。 【创新性】 本研究将首次阐述AGEs是否依赖于[Ca²⁺]导致内皮细胞通透性的增高,目前国内外还未有论文涉及此话题,研究结果将进一步揭示AGEs在糖尿病并发症、动脉粥样硬化相关疾病的机制。