【立论依据】 肝病临床难治,关键在于免疫应答不力。肝损伤程度与免疫调控密切相关,近年来发现的Th17/Treg细胞失衡,可参与多种疾病的发生发展,但在肝损伤的研究甚少。调节Th17增殖和功能的关键是转录激活因子STAT3。研究发现,一种去乙酰酶抑制剂LBH589可以阻断STAT3,引起Th17/Treg细胞变化。 【设计思路】 本实验拟建立免疫性肝损伤模型,从细胞、蛋白、基因水平对Th17、Treg细胞数量及功能进行评估,探究Th17/Treg细胞失衡与肝损伤的相关性及机制。并采用LBH589分别从体内、体外观测免疫调控效果。 【实验内容】 Wistar大鼠随机分为两组。尾静脉注射ConA建立模型组(CC),PBS注射建立对照组(HC)。CC组自第六周始腹腔注射LBH589(乙组),甲组注射PBS至建模结束,血清学肝功能检测及肝脏病理分析确定建模成功。取外周取血检测TIMP-1、HA水平。取PBMC体外细胞培养,用不同浓度LBH589处理(G2、G3),PBS处理作为对照组(G1),ELISA检测上清液IL-17、IL-6等相关细胞因子的含量。FCM检测Th17细胞和Treg细胞频率变化,计算Th17/Treg比值;免疫组织化学法检测Foxp3、RORγt蛋白表达情况;ELISA法检测外周血IL-17、IL-6等相关细胞因子。 【材料】 健康的雄性wistar大鼠、流式细胞仪、conA(白色冻干粉)、OLYMPUS400自动生化仪,免疫组化试剂、ELISA反应试剂盒、TIMP-1单克隆抗体试剂盒、DMSO溶剂、大鼠透明质酸ELISA试剂盒、96孔培养板。 【可行性】 课题思路逻辑、合理、创新,前期预结果良好。具备该课题实施所需的人员素质和实验环境。课题指导教师多年来致力于肝病的免疫学研究,并取得一定成果。所属实验室为山东省十二五重点实验室,国家级实验与教学示范中心,具有完善的实验科研环境。 【创新性】 肝病临床难治,关键在于机制不清。本课题首次提出把各细胞亚群的网络平衡学说应用于疾病的研究,认为肝病的发展演变,关键在于Th17/Treg细胞亚群的失衡,为肝病发生发展机制提供了理论依据。并通过阻断STAT3免疫调控Th17/Treg细胞平衡状态,以期肝脏损害发生改变,从而达到抑制病情的治疗目的,为其临床治疗提供新的线索。