【立论依据】 呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关。建立感染RSV的支气管上皮细胞(NHBE)模型,检测NHBE的增值、凋亡情况及NF-κB的转位,阐明NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中的作用,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法和思路。 【设计思路】 建立感染RSV的NHBE模型,检测细胞增值、凋亡情况以及NF-κB是否转位,定性定量地探讨呼吸道合胞病毒(RSV)是否通过诱导NF-κB激活介导人支气管上皮细胞(NHBE)凋亡。 【实验内容】 培养人支气管上皮细胞(NHBE),建立并鉴定RSV感染NHBE的体外细胞模型(用定量RT-PCR法鉴定细胞模型是否成功;设正常组、水相处理组、RSV感染组,MTT比色法检测RSV对NHBE增殖的抑制作用,感染组以不同滴度分为1 000、500、100、50、10 TCID50 5个组,感染12、48、72、96、120 h);用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测RSV诱导体外培养的NHBE的凋亡;以免疫荧光法和蛋白质印迹法检测经RSV处理的人支气管上皮细胞NF-κB的激活和对细胞凋亡的影响。 【材料】 人支气管上皮细胞(NHBE)细胞;RSV A亚型原型株Long株;细胞胞浆胞核蛋白提取试剂盒;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒;兔抗NF-κB抗体;电泳仪。 【可行性】 (1)呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关,感染RSV的人支气管上皮细胞模型容易建立成功。(2)本组成员长期跟随老师进行呼吸合胞病毒、流感病毒的研究,具有一定的科研基础和实验能力。(3)所需试剂、仪器、材料,医学基础实验中心基本都有配备,学校同时具备SPF级实验中心。 【创新性】 (1)首次从NF-κB角度探讨感染RSV的NHBE模型,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法思路。(2)分别使用免疫荧光法和蛋白质印迹法定性与定量检测RSV是否通过诱导NF-κB激活介导NHBE凋亡。