【立论依据】 作为一种新型而广泛存在的第二信使,环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)调控细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性、细胞周期等多种生理过程;而这些功能均与细菌的致病性及耐药性密切相关。在细菌中,环鸟苷二磷酸的代谢及胞内水平是由两种催化功能相反的酶共同起作用:鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase, DGCs)将两分子GTP转化生成一分子c-di-GMP; 而环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶 (phosphodiesterase,PDEs)则将c-di-GMP分解为pGpG,并最终水解为GMP。鸟苷酸环化酶具有高度保守的GGDEF蛋白结构域, 环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶则具有EAL结构域或较为少见的HD-GYP结构域,这些蛋白统称为环鸟苷二磷酸代谢蛋白(c-di-GMP metabolizing proteins)。铜绿假单胞菌模式菌株PAO1中有多达38个含GGDEF及EAL结构域的蛋白;然而,环鸟苷二磷酸是水溶性的小分子化合物;细胞内却存在如此多的担负环鸟苷二磷酸代谢功能的基因,这些具有“重叠性”的基因功能及其相互协调的机制完全不清楚。 【设计思路】 基因突变将导致表型变化,由此将表型与基因型相联系,从而使得对特定基因功能进行分析成为可能。 【实验内容】 本项研究利用细菌表型分析及PCR手段,比较不同的基因在细菌的生物膜合成及泳动性中的作用。 【材料】 以课题组拥有的多个GGDEF及EAL结构域突变的铜绿假单胞菌突变菌株为主要研究对象。 【可行性】 (1)已经拥有多个环鸟苷二磷酸代谢相关的突变菌株,实验材料有所保证;(2)涉及到的实验方法,例如细菌培养及PCR,均较为规范和易于掌握。 【创新性】 本项研究中涉及到的多个基因均未见详细的分析、鉴定;我们将以野生型为对照,在确定基因型的基础上,对突变体菌株的表型进行较为精细的分析、比较,由此为未来进一步的研究工作奠定基础。