【立论依据】 B-Myb是经典癌基因Myb家族的成员之一,其编码蛋白隶属于转录因子,在细胞周期和肿瘤发生发展过程中均具有重要作用。我们前期已发现,B-Myb在肺癌中表达异常上调,提示其在肺癌中具有重要作用,但其具体功能与分子机制仍不清楚,本课题拟对此进行研究。 【设计思路】 基于B-Myb在肺癌中表达上调,故选用“功能失活”策略进行研究。即:采用RNA干扰技术,抑制人肺癌细胞系H1299中B-Myb的高水平表达,构建B-Myb基因沉默稳定细胞株,分析B-Myb基因沉默后肺癌细胞的生长增殖、细胞周期和迁移侵袭能力以及全基因组基因表达谱的变化,由此初步揭示B-Myb在肺癌中的潜在作用与分子机制。 【实验内容】 首先,分别构建阴性对照和靶向B-Myb的RNA干扰质粒;然后,将上述质粒瞬时转染人肺癌细胞系H1299,结合嘌呤霉素抗性筛选和绿色荧光蛋白追踪,分别建立阴性对照和B-Myb基因沉默稳定细胞株,通过定量RT-PCR和蛋白质印迹技术检测确认B-Myb基因表达的抑制程度;最后,使用上述构建的稳定细胞株,分别采用MTT实验、流式细胞仪、软琼脂克隆形成实验、迁移侵袭实验对细胞的生长增殖、细胞周期分布、克隆形成能力和迁移侵袭能力进行分析,并通过基因芯片技术对全基因组基因表达谱进行检测。 【材料】 人肺癌细胞系H1299、细胞培养基、RNA干扰质粒、转染试剂、定量PCR试剂、B-Myb抗体、基因芯片等。 【可行性】 理论可行性:本课题是依据大量文献、我们的前期研究结果以及经典的分子肿瘤学理论,经过严密论证而提出。技术可行性:本课题采用的实验技术均为经典和成熟的肿瘤分子生物学研究技术,指导教师提供全程指导。 【创新性】 采用“功能失活”策略,综合运用RNA干扰、稳定细胞株构建、细胞表型分析和基因芯片技术,以期首次初步阐明B-Myb在肺癌中的作用与潜在分子机制,目前国内外尚未见报道。