【立论依据】 帕金森病(Parkinson's disease, PD)是第二常见的慢性神经系统退行性疾病。以往临床及尸检研究发现PD病人脑内组胺能系统处在激活的状态,本实验的前期工作发现组胺可加重6-OHDA引起的大鼠黑质内多巴胺能神经元的早期退变过程。但黑质是个细胞成分复杂的脑区,包括多种神经元和胶质细胞,而组胺本身又具有双重身份:即是神经递质,又是炎性介质,这就决定了组胺介入多巴胺能神经元损伤“微环境”的复杂性。本实验试图阐明组胺损伤多巴胺能神经元的细胞机制(黑质内哪些细胞参与)及其下游的分子机制(通过哪些受体或炎性介质起作用) 【设计思路】 选取PC12细胞及SH-SY5Y细胞,作为多巴胺神经元的细胞模型,以鱼藤酮造成细胞损伤,观察组胺及其多个受体拮抗剂对细胞生长的影响,以明确组胺是否直接介入鱼藤酮引起的多巴胺能细胞的损伤及其下游分子机制;选取Wistar胎鼠腹侧中脑进行混合神经元培养,以鱼藤酮特异损伤多巴胺能神经元,观察组胺对体系中各细胞成分形态的影响(GABA、Glu、5-HT能神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞),以明确黑质内其他细胞成分是否也组胺参与鱼藤酮引起的多巴胺能细胞的损伤及其下游分子机制。 【实验内容】 (1)①PC12、SH-SY5Y细胞的培养;②MTT法检测组胺及其多个受体拮抗剂+鱼藤酮对PC12和SH-SY5Y细胞生长的影响;③如有变化,应用流式细胞仪观察细胞凋亡及应用荧光分光光度计观察细胞内钙的变化;④如有变化,蛋白质印迹法观察其下游信号通路上某些蛋白的变化。(2)①Wistar胎鼠腹侧中脑神经元的培养;②细胞化学染色法观察组胺+鱼藤酮对体系内各细胞成分形态的影响;③如有变化,细胞化学染色法继续观察组胺各受体拮抗剂+鱼藤酮对该变化的影响;④如能明确某个受体介入该变化,蛋白质印迹法观察该受体下游信号通路上某些蛋白的变化;⑤如胶质细胞也有变化,ELISA法进一步检测胶质细胞释放炎性因子的变化。 【材料】 PC12和SH-SY5Y细胞株,Wistar孕鼠,培养液和血清,MTT,组胺及其各种拮抗剂、鱼藤酮、各种蛋白的抗体,Ca检测试剂盒,ELISA试剂盒 【可行性】 (1)申请人指导教师可保证经费充足;(2)指导教师所属院系实验室具备该实验所需的所有仪器设备;(3)已经购得PC12和SH-SY5Y细胞,并建立Wistar胎鼠腹侧中脑混合神经元培养,预实验初步发现:组胺H1/H2受体拮抗剂Pyrilamine/Cimetidine可以减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞的损伤。原代神经元培养结果显示,组胺可加重鱼藤酮引起的星形胶质细胞及小胶质细胞的增生。即,组胺介入鱼藤酮引起的多巴胺能神经元的损伤,即有直接作用,又有间接作用。 【创新性】 本实验试图揭示组胺参与多巴胺能神经元损伤的属性(神经机制或炎性机制),该研究对今后从何种角度寻找神经元保护药物(受体拮抗剂或抗炎药物)具有指导意义。