【立论依据】 内脏脂肪组织丝氨酸蛋白酶抑制剂Vaspin是2005年首次从自发性T2DM肥胖大鼠脂肪组织中分离得到的一种cDNA片段,人体内脏脂肪组织中也有表达,在代谢性疾病中起代偿作用。PPARγ与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗关系密切,PPARγ激动剂罗格列酮能使体外培养的3T3-L1 前体脂肪细胞Vaspin mRNA的表达上调。因此提出假设,PPARγ与Vaspin基因启动子上的某一基因片段结合从而发挥促进Vaspin表达的作用。 【设计思路】 首先测定3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化过程中PPARγ与Vaspin的蛋白表达谱,比较两者是否有相同变化趋势。然后构建Vaspin启动子-PGL3(含荧光报告基因)质粒和PPARγ-pcDNA3.1(+)质粒,转入293细胞,检测PPARγ是否使报告基因表达。再用启动子截短试验、结合位点的核苷酸点突变结合Gel mobility shift和荧光报告试验确定与Vaspin启动子结合的位点。 【实验内容】 首先在3T3-L1 细胞诱导分化过程的第0、2、4、6、8天,用蛋白质印迹法测定PPARγ与Vaspin的蛋白表达谱。再PCR扩增小鼠Vaspin 启动子-1200bp的DNA序列,用Cloning方法构建Vaspin启动子-PGL3质粒和PPARγ-pcDNA3.1(+)真核载体,转染入293细胞中,检测PPARγ能否使报告基因表达,再分别加入PPARγ激动剂和抑制剂,检测报告基因表达是否增加和减少。再用启动子截短试验,确定PPARγ与Vaspin启动子结合的位置区间。最后利用结合位点的核苷酸点突变结合Gel mobility shift和荧光报告试验确定PPARγ与Vaspin启动子结合的位点。 【材料】 3T3-L1细胞,293细胞,小鼠全基因,PGL3质粒,pcDNA3.1(+)质粒,PPARγ激动剂,PPARγ抑制剂。 【可行性】 文献提示PPARγ可能对Vaspin的表达起促进作用。实验平台为复旦大学分子医学教育部重点实验室,设备优良齐全。所需的各项实验技术和材料均已得到成熟广泛的应用。指导教师在脂肪细胞分化中的基因转录调控方面研究经验丰富,课题组成员具备优良的基础医学知识水平和实验操作水平。 【创新性】 目前国内外无任何研究证实PPARγ对Vaspin的表达有直接促进作用,也无相关机制的报道。本实验成果不仅是Vaspin表达机制的新发现,还是对PPARγ功能的新补充,能够为2型糖尿病和肥胖等代谢性疾病的预测和治疗提供新靶点。