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| 【立论依据】 AMPK是细胞及整体能量稳态的调控器。代谢综合征状态下,机体组织广泛存在AMPK活性下降,但AMPK如何失活仍存许多疑问。因此,弄清楚AMPK的失活机制对阐明代谢综合征的发病机制具有重要意义。 【设计思路】 有研究表明CDK5在肥胖小鼠脂肪组织中异常激活,AMPKα2的活性显著降低。同时,AMPKα2 345和529位丝氨酸满足Cdk5的底物一般都具有特定S/TPXK/R序列的条件。据此推测:活化的CDK5能够磷酸化AMPKα2 345和529位丝氨酸,进而抑制AMPKα2的活性,参与代谢综合征的发病。本课题拟在3T3-L1前脂肪细胞上研究Cdk5介导的AMPKα2蛋白磷酸化的作用,为代谢综合征和糖尿病的治疗提供新的思路。 【实验内容】 应用lipofectamine2000转染技术构建Cdk5 siRNA基因的脂肪细胞系3T3-L1-Cdk5 siRNA实验组及其阴性对照组细胞系3T-L1- Mock siRNA(Mock siRNA 为空siRNA转染),实验分为3T3-L1-Cdk5 siRNA组,3T-L1- Mock siRNA 组和3T-L1组,以AIMV无血清培养基培养3T3-L1细胞,使其自然增殖,于增殖第3天起用TNF-α作用于增殖中的3T3-L1细胞,之后每24小时以MTT法观察细胞增殖情况;采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,于诱导分化第8天起用TNF-α作用于分化中的3T3-L1细胞,此后每3天以油红O染色并染料提取的半定量方法及细胞内甘油三酯测定的方法了解细胞内脂质含量;采用细胞Cdk5/P35和AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒检测3T3-L1细胞中Cdk5和AMPKα2的活性,蛋白质印迹的方法检测3T3-L1细胞AMPKα2 S345 、AMPKα2 S529及AMPKα2S345、529磷酸化水平。从而观察CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。 【材料】 3T3-L1前脂肪细胞,AIM-V medium,DMEM/F12 培养基,Cdk5 siRNA, AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒,油红O, CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 Cdk5是脯氨酸引导的丝/苏氨酸蛋白酶,特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。其磷酸化底物一般都有特定的S/TPXK/R序列。而人、大鼠和小鼠AMPKα2蛋白序列的自动抑制区345位丝氨酸和亚单元结合区域529位丝氨酸有共同的序列YLASSPPSGS 和TGSTLSSVSP,满足Cdk5的底物一般都具有特定的S/TPXK/R序列的条件,实验假设理论上具有可行性。 【创新性】 本课题以Cdk5介导AMPKα2磷酸化进而抑制其活性为切入点,探讨对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,具有一定的创新性。 |
| 关键词: Cdk5 3T3-L1前脂肪细胞 AMPK |
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