【立论依据】 肝卵圆细胞的定向分化可为肝细胞移植和生物人工肝提供丰富的肝细胞源。阐明肝卵圆细胞分化的分子机制,是实现控制其定向分化的基础和前提。前期研究显示:miR-382在肝干细胞分化过程中表达上调,提示miR-382可能促进肝干细胞的分化过程。然而,目前对于miR-382在肝干细胞分化中的作用和分子机制仍知之甚少。 【设计思路】 本项目拟利用肝细胞生长因子(HGF)诱导大鼠肝前体细胞WB-F344向肝实质细胞分化的细胞模型,观察miR-382在肝前体细胞WB-F344分化进程中的表达变化,并从功能学和分子标志物两方面检测该microRNA分子对肝卵圆细胞分化的作用,并通过寻找该microRNA分子的靶基因初步明确miR-382调控肝干细胞分化的分子机制。 【实验内容】 (1)建立HGF诱导大鼠肝上皮样干细胞WB-F344肝向分化的细胞模型,并通过糖原染色和肝分化标志物的检测证实该模型的有效性。(2)通过qPCR的方法检测miR-382在整个诱导分化进程中的表达变化。(3)从功能学指标和分子标志物指标两方面检测miR-382过表达或者低表达对WB-F344细胞分化的影响。(4)miR-382通过靶向抑制候选靶基因Ezh2的表达提高肝干细胞的分化能力。 【材料】 大鼠肝前体细胞WB-F344,肝细胞生长因子HGF,Trizol 试剂,Lipofectamine 2000转染试剂,MiR-382 mimics等等。 【可行性】 (1)项目组成员均系统学习了细胞生物学和分子生物学的知识和实验操作技能,对科研有浓厚的兴趣,并已加入指导教师课题组进行科研项目训练。(2)项目指导教师承担的浙江省教育厅课题(Y201330031)包含肝干细胞定向分化的研究,积累了丰富的肝实质细胞诱导分化经验。 【创新性】 (1)本项目首次研究miR-382在肝干细胞分化中的作用,该研究有助于我们认识miR-382的功能。(2)本项目首次提出miR-382通过调控表观遗传修饰酶Ezh2的表达影响染色质修饰状态并参与肝干细胞分化的作用机制,本实验数据将丰富我们对肝干细胞分化过程中表观遗传修饰的认识,具有一定的理论意义。