【立论依据】 最新发现,Aire极有可能也是一种多能干细胞标记基因;Aire+的胸腺髓质上皮细胞(mTEC)很可能是一类多潜能的前体细胞,尚无明确的实验证据;豚鼠胸腺组织体外培养能新形成“胸腺小体”,不再被其特异性抗体KL1标记,仍能被KL4标记,但其他抗原,如Aire的表达情况未知;提示从mTEC分化到成熟HC中间可能还有不成熟的过渡态。 【设计思路】 发现问题:胸腺小体(HC)功能尚不清楚。提出问题:高度分化的HC能否去分化?大胆假设:HC就像干细胞的贮藏库,某种条件下能去分化,表现干性,成为胸腺干细胞甚至多能干细胞的源泉;胸腺只有mTEC表达Aire,HC不表达Aire,让不表达Aire的HC表达Aire,能否实现分化逆转,诱导多能性? 【实验内容】 手术分离豚鼠胸腺,建立2种体外培养体系。体系A:组织块培养法体外重现“胸腺小体”,K5和K8、KL4和BrdU、Aire、Involucrin双标记免疫荧光组织化学比对HE染色切片联合定位,鉴定新形成的“胸腺小体”;体系B:KL1包被免疫磁珠纯化胸腺小体上皮细胞(HCEC),饲养层3T3细胞体外培养HCEC,构建豚鼠Aire基因真核表达载体重组质粒导入HCEC,RT-PCR 检测豚鼠HCEC有无目的基因Aire、胸腺上皮祖细胞(TEPC)标志基因K5、K8及干细胞标志基因Oct4、Nanog、Sox2、Lin28等表达。 【材料】 豚鼠,超净工作台,手术器械,切片机,倒置显微镜,离心、电泳、MACS分选设备,PCR体系,紫外产品,培养瓶&皿&基,明胶,血球计数板,pH计,分光光度计,电子天平,冰箱,摇床,培养箱,恒温水浴锅,液氮罐,移液器,质粒载体,工具酶,DH5α,LipofectamineTM2000,3T3,丝裂霉素C,胰蛋白酶,FBS,缓冲液,H.E试剂,一抗,荧光二抗等 【可行性】 依托南昌大学医学实验教学中心,省医科院闵卫平院长支持,创新实验项目基金保障;2位导师分别从事不同学科领域,经验丰富;团队更有留德免疫学博士张瑜娟加盟助力。 【创新性】 首次报道胸腺小体的分离、纯化、体外培养及诱导去分化(中心环节、技术难点);胸腺小体功能谜题;多能干细胞假说;胸腺干细胞移植,重建T细胞库,先天性或AIDS等免疫缺陷病治疗希望。