【立论依据】 KCNE1/KCNQ1(IKs)为电压依赖性钾离子通道,介导心肌细胞动作电位复极化3期中的IKs电流。KCNE1的突变会造成高致死性的LQT综合症(V型)。KCNE1为通道调控亚基,对通道功能的实现具有重要意义。在其调控下,通道表现为缓慢激活特征,失活速度减慢,并且通道电导率明显增大。KCNQ1单独形成的通道,表现为快速激活和快速失活,通道电导性较小。KCNE1是由129个氨基酸构成的单次跨膜蛋白,分胞外段(N端),跨膜段(M段)和胞内段(C端)。N端包含42个氨基酸,关于该段的功能,研究极少,对其认识仍不全面,仅被报道与蛋白转运有关。本课题主要探究该蛋白N端的功能,研究关于该段可能有的更多的生理功能,并分析该段核心功能区段。 【设计思路】 通过分子技术制备KCNE1的N端缺失突变体,将其分别与KCNQ1共表达:以蛋白质印迹技术获得上述突变体的蛋白表达差异图谱,从而了解各个突变体的蛋白表达差异;以细胞免疫染色方法观察各突变体的亚细胞定位情况,从而了解N端缺失的部位对细胞定位的影响;以全细胞膜片钳技术检测各突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征,从而了解N端缺失的部位对KCNE1功能的影响。最后,通过以上数据的综合分析评估KCNE1N端的功能,以及N端的核心功能部位。 【实验内容】 KCNE1的N端缺失突变体的制备及其蛋白表达;野生型和突变体(与KCNQ1共表达)的细胞免疫染色;利用全细胞膜片钳技术,获得各缺失突变体与KCNQ1共表达后的通道功能的电生理数据。 【材料】 KCNE1、KCNQ1哺乳动物细胞系表达质粒;哺乳动物表达细胞系HEK293。 【可行性】 缺失突变体制备技术成熟,其他各项实验技术为实验室常用技术;理论基础充分,思路清晰;经文献查证对于KCNE1胞外段功能研究的尚无此类报道,因此该项目具有研究意义。 【创新性】 采用缺失突变体技术,通过多种实验方法从多个角度探讨蛋白特定部位的功能,是首次较深入探讨KCNE1蛋白特定区域的功能,对蛋白功能的深入了解,有助于积累临床治疗的理论依据。