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| 【立论依据】 蛋白质磷酸化是细胞信号转导的重要调控机制,由蛋白磷酸酶和蛋白激酶协同调控。人体内由100多个酪氨酸磷酸酶和近40个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶完成大约2万5千个蛋白的去磷酸化反应,其磷酸酶与底物的作用机制及其选择性是细胞信号转导的核心问题之一。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶有十分重要的作用,而许多底物仍然未知,所以我们主要研究此类磷酸酶。PPM1A是金属离子依赖性蛋白磷酸酶,属于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶中的PP2C家族,目前已经有人对其进行了一些研究,因此我们将PPM1A作为本课题的切入点。 【设计思路】 首先,本课题将对PPM1A的催化机制及底物特异性进行研究。然后,基于对PPM1A催化机理的阐明,本课题将发明一种全新的底物陷阱技术——substrate trapping,从而为整个PP2C磷酸酶家族底物的阐明带来革命性的变化。我们将利用这种新发展的底物陷阱技术,发现重要的PP2C磷酸酶家族成员,如PPM1D和PPM1G的未知底物。Substrate trapping是一种发现酶的未知底物的新方法。由于酶与底物反应迅速,没有充足的时间捕捉底物的信息,而酶的“陷阱突变体”可以结合底物但不水解底物,即底物亲和力、底物特异性不变,但催化活性降低,从而可以帮助我们找到未知底物。 【实验内容】 (1)构建PPM1A的不同突变体,用小分子底物pNPP和短肽分别进行酶学分析,找到trapping mutant;(2)GST pull down验证找到的突变体的可行性;(3)将PPM1A的研究方法推广到PPM1D和PPM1G,进行酶学分析、免疫沉淀、质谱分析、GST pull down验证,从而找到未知底物。 【材料】 大肠杆菌 pNPP 分子筛 PCR试剂 浓缩柱 酶标板 多肽底物等。 【可行性】 (1)已探索出一种PPM1A的突变体,对底物的特异性和亲和力不变,但催化活性很弱。(2)已表达纯化出PPM1D和PPM1G的部分突变体,并进行了酶学分析。 【创新性】 (1)揭示PPM1A最基本的催化机制与酶学特性;(2)首次在丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族中提出底物陷阱分子技术,在未来科研与临床应用中拥有广阔的前景。 |
| 关键词: 底物陷阱技术 催化机制 PPM1A PPM1D PPM1G |
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