【立论依据】 淋巴酪氨酸磷酸酶(LYP)是经典PTP家族的非受体型成员之一,在免疫细胞的信号调控中发挥关键作用。研究显示,LYP的单核苷酸多态C1858T与多种自身免疫性疾病相关,该单核苷酸多态使LYP产生功能增强型的R620W 突变,因此,发展LYP抑制剂是治疗自身免疫性疾病的一种潜在方法。 【设计思路】 我们的目的是快速、高通量地从化合物库中筛选LYP抑制剂,进行生化研究,筛选出潜在的抑制剂,并排除假阳性结果、筛选对LYP具有选择性的抑制剂,并利用晶体结构分析、构建点突变等方法探究抑制剂与LYP作用的分子机制,同时研究抑制剂在体内的作用效果,为加快临床抗自身免疫药物的研究做贡献。 【实验内容】 我们应用了靶点结合基础上的虚拟筛选方法来确定LYP的抑制剂,并把筛选方法和酶活测定结合在一起。主要的研究内容如下:(a)运用虚拟筛选方法从化合物库中选择LYP的潜在抑制剂。(b)初筛,测定抑制剂浓度为10μM时LYP对pNPP的水解能力,选择使LYP活力降低的化合物进一步研究。(c)测定抑制剂的IC50,排除初筛时的假阳性。(d)测定抑制剂对其他PTP的IC50,检测抑制剂的选择性。(e)测定抑制剂对LYP的林-贝双倒数曲线,确定结合方式。(f)将Jurkat T细胞与抑制剂孵育,给予anti-CD3刺激,检测TCR信号通路中ERK、LCK的磷酸化水平。 【材料】 大肠杆菌 pNPP 分子筛 PCR试剂 浓缩柱 酶标板等。 【可行性】 我们根据晶体结构筛选到了23种可能的新型抑制剂,其中9个在体外酶活实验中对LYP蛋白有较好的抑制结果,这些抑制剂的Ki均小于30 μmol/L。其中,抑制效果最好的4个(M1、M2、M3 和 M4)抑制剂对其它磷酸酶具有一定的选择性。进一步结果显示这些化合物是LYP的竞争性抑制剂,抑制效果最好的是M1,其Ki是2.87 μmol/L。细胞实验显示M1和M2能够上调TCR介导的信号途径。 【创新性】 (1)利用虚拟筛选的方法筛选LYP的抑制剂;(2)通过寻找蛋白磷酸酶的抑制剂来探索自身免疫疾病的治疗靶点。