星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。