【立论依据】 克隆选择学说认为,T细胞识别抗原的多样性在胸腺发育时形成。胚胎期或新生儿期,自身抗原在胸腺中表达时,相应T细胞克隆识别、发生凋亡,形成机体对自身抗原的免疫耐受,从而使未发生凋亡的T细胞只能识别非自身抗原,并活化增殖,诱导特异性免疫应答,若此时在胸腺中表达了非自身抗原,则识别它的细胞将发生凋亡,使机体形成病理性耐受。在我国,50%的慢性乙肝患者在宫内或幼年时期即感染乙肝病毒(HBV),此时,机体免疫系统处于胸腺发育阶段,胸腺表达HBV抗原,导致识别HBV特异性T细胞被清除,造成对HBV的病理性耐受。因此我们拟将HBV特异性T细胞从胸腺中“拯救”出来,以治疗通过垂直传播而感染HBV的患者。 【设计思路】 为打破对HBV抗原的病理性免疫耐受,我们拟从胸腺提取HBV特异性T细胞,体外培养、增殖,再回输体内,不仅提高机体特异性清除HBV的免疫应答能力,同时避免了机体的免疫排斥反应。 【实验内容】 (1)建模:DHBV(鸭乙肝病毒)感染出壳24 h的幼鸭,以诱导免疫耐受;(2)获得DHBV致敏树突状细胞(DC):分离外周血中DC,用DHBV 冲击致敏DC,并用绿色荧光蛋白(GFP)标记DC;(3)分离DHBV特异性T细胞:取建模成功的3~4周龄鸭的胸腺组织,制成悬液,以致敏DC为标记,采用流式细胞术分选目标细胞;(4)质量控制:将目标细胞与感染、未感染DHBV的肝细胞共培养,检测其活性及安全性;(5)细胞因子体外刺激目标细胞增殖,腹腔回输。(6)检测鸭肝功能指标。 【材料】 DHBV、DHBsAb/DHBcAb、胰酶、RPMI 1640、rhGM-GSF、rhIL-4、rhTNFa、LPs等。 【可行性】 (1)过继免疫疗法技术成熟,已试用于临床,排斥反应少,疗效显著,使本研究具有实验可行性。(2)构建幼龄鸭DHBV免疫耐受模型已有文献基础,为本研究提供了实验材料。 【创新性】 (1)以克隆选择学说为理论基础,提出一种全新的过继疗法的细胞来源和操作思路,将为其他免疫耐受性疾病及病毒感染的治疗提供研究策略;(2)采用自体T细胞免疫疗法,实现特异性清除体内乙肝病毒目的,较传统疗法更具特异性和靶向性。