【立论依据】 高危型HPV在感染过程中产生的病毒源性癌蛋白E6、E7在宿主细胞中呈过度表达,是致宫颈癌的关键因素。已经证实,病毒基因组整合到宿主染色体是HPV致癌的重要因素。HPV DNA的整合不但改变整合位点及临近宿主基因的表达,而且可使HPV衣壳蛋白基因(L1和L2)片段缺失,这严重限制了目前临床上使用的基于L1基因序列的HPV检测及分型。本研究拟选择宫颈癌组织高表达的E6、E7基因序列,设计特异性探针及引物,优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,可快速对宫颈癌组织中高危型HPV进行检测和分型。 【设计思路】 设计HPV不同型别E6/E7特异性探针及引物,优化PCR条件,扩增宫颈肿瘤组织标本中高危型HPV E6/E7基因,结合测序,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,对宫颈癌组织高危型HPV进行检测和分型,并与目前临床上广泛使用的检测方法比较,验证该方法的敏感性和特异性。 【实验内容】 收集低度上皮内瘤变(LSIL)、高度上皮内瘤变(HSIL)和宫颈癌组织样本等不同类型的宫颈肿瘤组织标本,抽提DNA;根据高危型HPV早期基因 E6/E7基因序列,在同源性分析的基础上,设计HPV不同型别的E6/E7特异性探针及引物, PCR扩增宫颈肿瘤组织标本DNA,通过基因测序验证PCR扩增的特异性;进一步优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,检测宫颈肿瘤组织标本中HPV感染及型别,并与目前临床上使用的检测试剂盒比较,分析检测的灵敏性和特异性。 【材料】 LSIL组织样本、HSIL组织样本和宫颈癌组织样本各30例; HPV16+Siha细胞、HPV18+Hela细胞;不同型别HPV的E6/E7特异性探针及引物;高保真PCR酶及反应体系;琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳检测系统等。 【可行性】 本项目立论依据充分,标本来源丰富,前期预实验已运用此方法对高危型HPV16/18完成初步分型。 【创新性】 迄今尚无相关研究报道。本检测方法的建立为我国高危型HPV流行检测及宫颈癌疫苗的推广奠定基础。