【立论依据】 前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是男性恶性肿瘤的第一杀手。近期研究表明细胞自噬作为双刃剑在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的生理与病理过程中发挥重要的作用,但目前细胞自噬如何调控前列腺癌的机制尚无报道。p21活化激酶-6(p21-activated kinase 6,PAK6)是丝/苏氨酸蛋白激酶PAK家族的一员,通过磷酸化雄激素受体与肿瘤E3连接酶而泛素化降解雄激素受体,从而负向调节前列腺肿瘤的生长。HDAC6是Ⅱ类组蛋白脱乙酰化酶的一个成员,通过调节底物乙酰化水平促进肿瘤的生长与转化。已有文献报道,PAK6在前列腺癌中呈高表达,而HDAC6具有促进自噬小体形成的作用。我们前期的研究结果发现,PAK6可通过结合HDAC6从而诱导细胞发生自噬,且临床标本的免疫荧光结果显示PAK6与HDAC6共定位于细胞质中,且恶性前列腺癌中的共定位明显高于正常前列腺组织,提示两者在前列腺癌中发挥重要作用。因此本实验旨在探讨PAK6与HDAC6相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌中的发挥的生物学功能及调节机制。 【设计思路】 应用体内外结合实验研究二者在细胞内的相互作用。电镜及蛋白质印迹技术检测PAK6与HDAC6与细胞自噬的关系,及PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。免疫组化检测二者在前列腺癌临床标本中表达的相关性。 【实验内容】 (1)体外GST-pull down实验证实PAK6与HDAC6直接结合。(2)共转染HDAC6和PAK6到工具细胞HEK293中,免疫共沉淀检测二者在细胞内结合。(3)成功构建过表达和沉默PAK6细胞系,利用MTT,细胞计数及蛋白质印迹实验揭示PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。(4)免疫组化分析前列腺癌组织临床标本中PAK6与HDAC6表达的相关性。 【材料】 前列腺癌及工具细胞系,相应抗体, ECL发光试剂及仪器,共聚焦激光显微镜。 【可行性】 所在实验室为教育部医学细胞生物学重点实验室。前期实验成功证明PAK6和HDAC6的结合及共定位关系,本人已熟练掌握了后续实验涉及的相关技术。 【创新性】 本研究首次发现PAK6和HDAC6在前列腺癌中的共定位表达变化及二者的相互作用,阐明PAK6通过HDAC6促进细胞自噬,为寻找前列腺癌的预警分子提供理论基础。