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| 【目的】 L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)是生物转化生产功能性糖L-阿拉伯糖的关键酶。尽管对L-AI的研究已达数十年,但直到2006年,首个来源于大肠杆菌(E. coli)的L-AI(ECAI)的晶体结构才被解析出来,但其最高分辨率仅为2.6,且只解析出了单酶的空间结构。到目前为止,虽然对L-AI的研究不断深入,但是未见有其晶体结构的相关报道。我们在研究过程中发现L-AI家族蛋白难以结晶,因此本文拟通过研究来源于一株嗜热菌的L-AI,研究导致其不能结晶的可能原因。 【方法】 通过分子克隆手段,实现嗜热菌L-AI编码基因在E.coli中的异源表达;通过镍柱亲和层析纯化得到L-AI纯酶;通过SDS-PAGE及蛋白质印迹检测,分析L-AI在溶液中的状态。 【结果】 SDS-PAGE结果显示,L-AI经过镍柱纯化后基本可达到电泳纯,即只有一条蛋白条带;蛋白质印迹结果显示,在目的蛋白条带上下方存在多条蛋白条带,上方条带可能是L-AI发生聚集所致,下方条带可能是L-AI被降解所致。 【结论】 实验表明,L-AI在溶液中不是以均一形态存在的,可能存在多种形态,而且L-AI易被降解。因此,影响L-AI结晶的可能原因包括蛋白聚集所导致的构象不均一以及目的蛋白被降解。 |
| 关键词: L-阿拉伯糖异构酶 蛋白质印迹 降解 聚集 |
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