【目的】 通过对原癌基因USP22的5'端启动子活性分析,获得 PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据并探索其中机制。 【方法】 克隆USP22基因5'端核心启动子,定向插入荧光素酶报告载体pGL3-Basic;重组质粒经脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞12 h后,分别采用PKA信号的激动剂Forkslin和抑制剂H-89刺激;双萤光素酶实验分析USP22启动子片段的相对活性;在此基础上,利用real-time PCR检测Forkslin和H-89对内源性USP22表达影响,以获得PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据;采用DNA定点突变技术,剔除该启动子区一个典型的CREB/ATF结合位点,经Forkslin和H-89处理,双萤光素酶检测以证实PKA信号通路通过CREB/ATF反应元件调控USP22的转录;最后,联合染色质免疫共沉淀(ChIP)与real-time PCR实验观察H-89对转录因子CREB与USP22启动子结合能力的影响。 【结果】 USP22基因的启动子活性及内源性mRNA表达受到PKA通路抑制剂H-89的显著抑制,但并未因为PKA的激活而出现明显上调;破坏CREB/ATF结合位点可消除USP22启动子对H-89的反应性;H-89抑制CREB与USP22启动子中CREB/ATF反应元件的结合导致USP22转录活性的下降。 【结论】 CREB/ATF结合位点控制着USP22基因的常规表达;USP22的转录受到PKA信号通路的正性调控;PKA信号通路通过转录因子CREB实现上述功能。