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| 【目的】 在前期证实粘蛋白1(MUC1)通过封闭TLRs信号通路抑制呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的呼吸道炎症的基础上,以TLRs细胞内段TIR结构域相互作用的结构特点为基础,通过生物信息学分析确定MUC1胞内段(MUC1 CT)抗炎多肽的候选区域,并构建各种候选区域的缺失突变体真核、原核表达载体,进而找出发挥抗炎作用的多肽片段,并在体外验证其抗炎效果。 【方法】 根据生物信息学技术预测分析MUC1 CT潜在的抗炎片段;构建MUC1 CT各种缺失突变体的真、原核表达载体,即pEGFP-C2-MUC1 CT mutants、pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants以及pET14b-MCS-SBP-EGFP-MUC1 CT mutants-TAT;转染pEGFP-C2-MUC1 CT mutants入A549细胞(来源于II型肺泡上皮细胞),利用荧光显微技术明确各绿色荧光蛋白标记的突变体蛋白的细胞内定位;转染pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants(无异常定位的突变体)入A549细胞,待MUC1 CT mutants高表达后,用RSV感染各组细胞一定时间后,使用ELISA方法测定细胞培养上清中TNF-α的水平,筛选发挥抗炎作用的多肽片段;在明确MUC1 CT的核心抗炎片段的基础上,转化pET14b-SBP-EGFP-MUC1 CT mutant入大肠杆菌(DE3),体外表达并纯化含有穿透肽(TAT)的MUC1 CT突变多肽,预先与A549细胞孵育,再给予RSV感染,通过测定上清中的TNF-α的水平,进一步明确具有抗炎活性的片段。 【结果】 (1)通过生物信息学分析MUC1 CT,确定四处具有潜在抗炎活性的候选区域,分别是氨基酸位点7-14位,19-26位,36-40位,44-53位;(2)成功构建基于pEGFP-C2和pcDNA3-HA真核表达载体的四种缺失突变体的真核表达载体;(3)通过pEGFP-C2-MUC1 CT mutants明确各种突变体的细胞内定位情况;(4)利用pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants明确MUC1 CT的抗炎片段;(5)通过带有TAT的MUC1 CT突变多肽进一步证实该段的抗炎活性。 【结论】 MUC1 CT抗炎片段在体外实验中具有抗炎性。 |
| 关键词: MUC1 抗炎多肽 体外构建 |
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