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| 【目的】 建立模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化的模型,从P16和RASSF1A基因甲基化和GADD45α、DNMTs蛋白表达的角度,研究模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化的分子机制。 【方法】 CCK8法确定模拟日光UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的单次辐射剂量;Gimsa染色从细胞形态角度初步确立模拟日光UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的终点;软琼脂克隆形成实验、明胶酶谱法检测MMP-9蛋白酶的分泌确立UVB辐射诱导人HaCaT细胞恶性转化模型的成功建立。实验设计分为2组:正常对照组、模拟日光UVB模型组。RT-PCR检测甲基转移酶DNMTs(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)mRNA的经时表达;蛋白质印迹法检测GADD45α、DNMT3b、P16及RASSF1A蛋白经时表达。高分辨率熔解曲线(MS-HRM)检测P16、RASSF1A基因甲基化程度的经时改变。收集每4次辐射后的结果进行讨论。 【结果】 UVB单次辐射剂量10 mJ/cm2×20次,成功建立模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化模型;首次通过 (DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)mRNA的经时表达证实模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞中DNMT1和DNMT3a的表达量与UVB辐射前相比无统计学差异,而DNMT3b的mRNA和蛋白的表达与辐射前相比随辐射次数增加逐渐升高,辐射20次后其表达量达到高峰(P<0.05);GADD45α蛋白的经时变化显示UVB辐射4次时即可检测到其表达量达到高峰,随后其表达量随辐射次数增加逐渐下降,辐射20次后其蛋白表达达到低谷(P<0.05);P16和RASSF1A蛋白的经时变化显示随UVB辐射次数增加其蛋白表达量逐渐下降,UVB辐射20次后P16和RASSF1A蛋白表达达到低谷(P<0.05)。 【结论】 在国际上首次建立模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化模型,揭示P16和RASSF1A基因的高甲基化与HaCaT细胞恶性转化密切相关,并且是DNMT3b和GADD45α参与调控P16和RASSF1A基因的高甲基化,而不是DNMT1和DNMT3a。 |
| 关键词: 紫外线B 恶性转化 GADD45α DNA甲基化 DNMTs |
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