【目的】 体外模拟角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC)的发育过程,利用生长因子和细胞外基质构建微环境,制备适当的条件培养基诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)分化为CEC。 【方法】 用丝裂霉素C处理胚鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs),接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。hESCs接种于MEFs饲养层,传代并免疫荧光鉴定。分割hESCs克隆团块,用拟胚体(embryonic bodies, EBs)培养基悬浮培养形成球形的EBs。用丝裂霉素C处理角膜基质细胞,接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。EBs接种于膜基质细胞饲养层,将SV-40转染的人晶状体上皮细胞接种于transwell小室与EBs共培养,EBs逐渐分化形成类角膜内皮细胞。环钻钻取新鲜猪眼球中央角膜片,脱细胞处理后,机械切取脱细胞猪角膜基质(acellular porcine cornea matrix, APCM),即获得APCM支架。倒置显微镜下剖切APCM后板层,甘油脱水。将hESCs来源的类角膜内皮细胞接种于APCM后弹力层表面构建CEC植片,培养7 d。 【结果】 hESCs培养6 d后可于饲养层上形成类圆形克隆团,在悬浮培养基中悬浮培养形成EBs。EBs于角膜基质成纤维细胞饲养层上与人晶状体上皮细胞系共培养,EB面积逐渐增大,中央部分形态发生变化,形成单层排列的多边形细胞。免疫荧光检测,可表达类角膜内皮细胞标记物Na⁺/K⁺ ATPase。类角膜内皮细胞接种于APCM支架培养,H-E染色证实后弹力层表面形成单层类角膜细胞结构。 【结论】 目前已经完成了hESC、人角膜基质成纤维细胞和人晶状体上皮细胞系的培养。实现了hESCs向角膜内皮细胞的诱导分化。完成了APCM的制备和鉴定。并成功以hESC和APCM构建了组织工程角膜内皮植片。植片的功能有待动物实验进一步研究。