Abstract:目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.

Abstract:目的:探讨腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体(soluble complement receptor type 1,sCR1) 基因转染对急性心肌缺血的保护作用.方法:开胸阻断小鼠左冠状动脉前降支起始部30 min后开放,实验组(14只)在开放冠状动脉前5 min于缺血区注射携带sCR1和LacZ的混合腺病毒液(100 μl,1010噬斑形成单位);对照组(13只)注射LacZ腺病毒液(100 μl,1010噬斑形成单位).术后2周时利用超声心动图检查心功能,并于检查后立即取标本行病理检查.结果:术后2周时,各项超声指标实验组都明显优于对照组(P<0.05);尤其是反映梗死范围大小的梗死范围率,差异非常显著(P<0.01).病理检查见实验组动物心肌梗死区域小于对照组,H-E染色显示实验组注射sCR1腺病毒的范围内存活心肌细胞明显多于对照组.结论:缺血心肌再灌注前注射sCR1腺病毒可以明显减小梗死范围,提高远期心脏功能.

Abstract:目的:探讨二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)对轴突退行性病变的影响.方法:DMSO溶断组:用DMSO 10 μl溶断处理原代培养的大鼠颈上神经节细胞使胞体与轴突分离,并分别设阳性对照组(用过量表达WldS蛋白的重组HSV病毒感染细胞,剔除胞体)、空白对照组和DMSO对照组(分别将10 μl PBS和DMSO加入培养基,切断轴突并去除胞体).分别于轴突与胞体分离即刻(0 h)及分离后4、8、12、24 h用4％多聚甲醛固定细胞,用抗神经特异的微管蛋白抗体做免疫荧光染色,观察轴突微管结构变化.收集轴突蛋白作免疫印迹分析,观察神经纤维(neurofilament)的降解情况.结果:DMSO溶断组在12 h时轴突的结构和形态没有明显改变,处理24 h后有轻微的轴突退行性病变;微管结构的崩解速度明显减缓,至12 h微管结构仍然能够维持完整;去除胞体后12 h,仍然能够检测到NF160神经元纤维蛋白.这种变化与阳性对照组非常相似,而空白对照组和DMSO对照组未见明显保护轴突退行性病变的作用.结论:局部高浓度的DMSO能够延缓轴突的退行性病变,提示DMSO可能用于神经退行性疾病的辅助治疗.

Abstract:目的:探讨插入甘氨酸(Gly)对HIV Tat-TK融合蛋白功能的影响.方法:利用基因重叠(gene splicing by overlap extension, gene SOEing)PCR技术,将不同长度的甘氨酸密码子(0、2、4、6个)插入HIV Tat-TK融合基因,经转染、鉴定证实后诱导表达,并经偶联Tat单克隆抗体的Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化.4种HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白(n=0、2、4、6)、HIV Tat蛋白、TK蛋白(1 μg/ml)分别与HepG2细胞在普通培养基共培养24 h后,间接免疫荧光检测各自透过细胞膜效率;在加入更昔洛韦的培养基培养3 d后,锥虫蓝染色计算细胞死亡率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:精确克隆出HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合基因,成功表达HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白以及HIV Tat和TK蛋白.HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白与HIV Tat蛋白透过细胞膜的效率相似,但单独TK蛋白无法进入细胞;在含有更昔洛韦的培养基中HIV Tat-(Gly)4-TK融合蛋白致HepG2细胞凋亡率最高(14.77％),其余依次为HIV Tat-(Gly)2-TK融合蛋白(12.69％)、HIV Tat-TK(8.31％)、HIV Tat-(Gly)6-TK(4.36％)和HIV Tat 组(1.03％),组间均有显著性差异(P<0.05);细胞死亡率也发现类似的结果(分别为80.2％、65.4％、58.4％、56.7％、9.1％,组间有显著差异,P<0.05).结论:插入2、4、6个甘氨酸对HIV Tat-TK融合蛋白上游Tat蛋白的细胞融合穿透功能不产生影响,而对融合蛋白下游TK蛋白介导的更昔洛韦的细胞毒作用干扰较大,其中插入4个甘氨酸对TK蛋白介导的更昔洛韦的细胞毒作用影响最小.

Abstract:目的:观察结直肠癌与癌旁组织中Bcl-2、Bcl-xL 和Bax的表达,探讨它们在结直肠癌发生发展中的可能作用.方法:RT-PCR、免疫组化MaxVision一步法分别检测40例结直肠癌组织与癌旁组织中Bcl-2、Bcl-xL 和Bax mRNA表达及其相应蛋白表达水平.结果:癌组织和癌旁组织的Bcl-2 mRNA及其蛋白表达水平都很低,两者之间无显著差异;两者Bcl-xL mRNA及蛋白表达水平均较高,且癌组织明显高于癌旁组织(P<0.05);两者Bax mRNA及蛋白表达水平均较Bcl-2、Bcl-xL高,但两者间无显著差异.两者Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bax的比值间无显著差异.Bcl-2蛋白表达与Dukes分期和TNM分期都呈负相关(P<0.05),与其他临床病理相关因素(性别、年龄、肿瘤大小、发生部位、组织学类型、分化程度)无明显相关;而Bcl-xL 、Bax在基因及蛋白水平的表达均与临床病理相关因素无关.结论:结直肠癌中Bcl-xL在基因及蛋白表达水平明显强于Bcl-2,且明显高于癌旁组织;前者可能促进了肿瘤的发生发展.Bcl-2蛋白表达与肿瘤分期呈负相关,可作为评价结直肠癌临床预后的参考指标.

Abstract:目的:研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA-4Ig)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)单抗体内注射促进供者未成熟树突状细胞(imDC)诱导受者免疫耐受的可能机制.方法:实验分对照组(仅输注imDC)、CTLA-4Ig组、ICAM-1单抗组和CTLA-4Ig+ICAM-1单抗联合组,每组均以2×106 C57BL/6供者imDC经尾静脉输注受鼠(雄性),自imDC输注之日起连续2周向受鼠腹腔内注射CTLA-4Ig或(和)ICAM-1单抗(0.1 mg/d),DC输注1周后4组均行异位心脏移植,于心脏移植后7 d和21 d,进行免疫学分析.结果:CTLA-4Ig或联合ICAM-1单抗治疗后均明显抑制同种imDC免疫的移植受体脾脏T细胞对同种抗原刺激的增殖反应,降低淋巴细胞毒活性,明显抑制血清和MLR反应中Th1细胞因子IL-2、IFN-γ的产生,显著提高Th2细胞因子IL-10的水平;明显降低心脏移植受体同种抗体IgG的产生.ICAM-1单抗治疗组的受体T细胞对同种抗原刺激的增殖反应虽有减弱,但与对照组相比没有显著的差异;对MLR反应上清和血清中IL-2的产生有明显的抑制,而对其他细胞因子的产生没有明显的作用.结论:CTLA-4Ig联合ICAM-1单抗治疗可通过诱导受体T细胞对同种抗原特异性的低反应性,抑制淋巴细胞毒活性和B细胞的体液免疫反应,并促进Th2细胞的极化来促进imDC诱导的同种抗原特异性的免疫耐受.

Abstract:目的:从绿豆中提纯天然的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI) ,并测定了它对前体加工酶的抑制活性.方法:通过硫酸铵沉淀、分子筛层析、离子交换、亲和层析和反相高压液相等一系列层析方法,纯化了MBTI;通过筛选得到两种蛋白质前体加工酶Kexin和Furin的高表达酵母菌株和COS-7细胞,用硫酸铵沉淀和分子筛的方法纯化这两种前体加工酶,并测定和计算MBTI对其的抑制活性.结果:纯化的MBTI在HPLC上洗脱为单峰,在SDS-PAGE中为单一条带.MBTI对Kexin的抑制常数达到3.9×10-9mol/L,对Furin有一定的抑制活性,但是抑制活性较弱 .结论:MBTI对于Kexin和Furin两种蛋白前提加工酶都有抑制活性,尤其对Kexin抑制活性明显,如经进一步改造将有望成为理想的蛋白前体加工酶抑制剂.

Abstract:目的:建立原位移植裸鼠模型,筛选同一标本来源的转移性和非转移性肾细胞癌(RCC).方法:采用皮下移植法、细胞悬液原位注射法、肾周筋膜内法、组织块原位移植肾包膜下法对BALB/c裸小鼠接种(或注射)RCC组织块(或细胞悬液),观察各种方法的成瘤及转移情况,并采用免疫组化方法初步对比分析了VEGF、bFGF、P16、Bcl-2、C-met在裸小鼠体内的转移性和非转移RCC的表达情况.结果:(1)组织块原位移植肾包膜下法成瘤率及转移率最高,分别为73.3％(11/15)、20％(3/15).(2)与原发灶相比,转移灶中VEGF表达明显升高(P<0.05),C-met表达明显降低(P<0.05),bFGF、Bcl-2、P16表达降低但无统计学差异(P>0.05).结论:组织块原位移植肾包膜下法是切实有效的RCC转移模型制作方法.采用该法在裸鼠中获得了人转移性和非转移RCC,免疫组化分析证实了转移性RCC中新血管生成因子VEGF表达显著增加.

Abstract:目的:研究脓毒症对肝功能及相关酶活性的影响,探讨Leptin在急性炎症反应中的作用.方法:建立小鼠盲肠结扎致脓毒症模型,设立假手术组、脓毒症组、Leptin保护组(腹腔内注射0.1 mg/kg Leptin)和消炎痛(吲哚美辛)保护组(腹腔内注射2 mg/kg 消炎痛).于脓毒症后6 h和12 h,采用放射免疫法测量肝组织匀浆液中Leptin水平,采用96孔分光光度法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)等4种与自由基合成、解毒和嘌呤生成代谢相关的酶的水平,同时以H-E染色法观察肝组织病理学改变.结果:与假手术组相比,脓毒症组伤后12 h血清ALT明显上升(P<0.05),6 h时无显著改变.Leptin保护组在12 h时可见ALT显著低于脓毒症组水平(P<0.05),消炎痛保护组在6 h和12 h时有ALT下降,但无显著差异.Leptin保护组和消炎痛保护组肝组织内MPO活性没有显著变化,但GST和SOD活性明显降低(P<0.01,P<0.05),同时XOD活性明显增加(P<0.05).另外,脓毒症组肝内Leptin有下降趋势,Leptin保护组肝内Leptin水平有所恢复,而消炎痛保护组肝内Leptin水平也有所恢复,但在12 h时与脓毒症组有显著差异(P<0.05).结论:Leptin对脓毒症造成的肝功能损害有明显保护效应,其保护作用可能涉及肝细胞代谢过程中氧化-还原反应、氧自由基形成和解毒功能的调节.

Abstract:目的:研究血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对大鼠胰星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)增殖和活化的影响.方法:取第4～7代培养的大鼠PSCs,采用无血清DMEM培养液培养48 h使细胞同步静止化后,换含1、10和100 nmol/L Ang Ⅱ的无血清培养液继续培养24 h或48 h;另外,在加入100 nmol/L Ang Ⅱ无血清培养液前加入100 nmol/L AT1受体拮抗剂ZD7155或AT2受体拮抗剂PD123319.分别采用[3H]-胸嘧啶核苷掺入、[3H]-脯氨酸掺入、Western印迹和Northern印迹法动态检测细胞DNA合成速率、胶原合成速率、α-平滑肌动蛋白和Ⅰ型前胶原mRNA表达.结果:与正常对照组比较,1 nmol/L Ang Ⅱ刺激24 h后细胞DNA合成率无显著增加(P>0.05),而10和100 nmol/L处理组细胞DNA合成率显著增加(P值均<0.05);刺激48 h后,1、10和100 nmol/L Ang Ⅱ处理组细胞胶原合成率和Ⅰ型前胶原mRNA表达水平均明显增加(P值均<0.05),但α-平滑肌动蛋白表达无明显变化(P值均>0.05).与Ang Ⅱ(100 nmol/L)处理组比较,Ang Ⅱ(100 nmol/L)+ZD7155(100 nmol/L)处理组细胞DNA合成率、胶原合成率和Ⅰ型前胶原mRNA表达水平均显著下降(P值均<0.01),而Ang Ⅱ(100 nmol/L)+PD123319(100 nmol/L)处理组均无明显变化(P值均>0.05).结论:Ang Ⅱ通过AT1受体介导,可剂量依赖性诱导大鼠PSCs增殖和胶原合成,从而参与胰腺纤维化的发生.

Abstract:目的:探讨α-硫辛酸对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响.方法:体外条件下采用正常糖浓度(5.6 mmol/L,NG)、高糖浓度(25 mmol/L,HG)及HG+不同浓度α-硫辛酸(50、100、200、300 μmol/L)分别与大鼠系膜细胞共同培养不同时间(12、24、48 h).MTT法测定系膜细胞增殖;RT-PCR法检测细胞ICAM-1 mRNA的表达;ELISA法测定细胞培养上清ICAM-1蛋白的浓度. 结果:50～300 μmol/L的α-硫辛酸可抑制系膜细胞增殖.高糖刺激24 h时, 200 μmol/L的α-硫辛酸干预组ICAM-1的蛋白浓度[(288.4±23.4) ng/ml]明显低于HG组[(542.3±35.6) ng/ml,P<0.01].100 μmol/L及200 μmol/L的α-硫辛酸均可下调高糖诱导的ICAM-1 mRNA的表达.结论:一定浓度的α-硫辛酸可抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,并可降低ICAM-1蛋白和mRNA的表达.

Abstract:目的:研究不同种质红花药材的指纹图谱.方法:采用高效液相色谱法(HPLC)对分布于我国11个省份的红花药材(共36份样品)进行色谱分离,色谱条件:Agilent Zorbax C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈-0.5％磷酸水溶液梯度洗脱,运行时间为60 min;流速1.0 ml/min;检测波长265 nm;室温为20℃.使用"中药指纹图谱工作站"(第二军医大学药学院药物分析学教研室等编制)进行数据处理,对不同种质红花药材进行聚类分析,并对其相似度进行分析.结果:来自我国11个省份的不同种质红花药材可以聚为两类,生长于西北地区的红花品种之间相似度较高;生长于中部、南部地区的红花品种之间相似度较高.红花种质药材的指纹图谱相似度差别明显.结论:红花种质化学组成差异显著,固定种质来源对保障红花质量的稳定性极为重要.

Abstract:目的:探讨实时超声造影在评价冠心病患者左室整体与局部心功能中的价值.方法:对22名行冠脉旁路移植手术的患者进行实时心肌造影,分别于超声造影前后观察心内膜边界显示情况,评价节段室壁肌运动情况,测量左室射血分数并与X线左室造影测量结果进行比较.结果:超声造影后左室心内膜边界显示较造影前明显清晰,显示不清的节段减少,清晰显示的节段增多,记分指数增高(P<0.05).造影前测量的左室射血分数与X线左室造影结果比较差异显著(P<0.05),相关性较低((r=0.46, P<0.05);造影后测量的左室射血分数与X线左室造影结果无显著差异(P>0.05),且相关良好(r=0.87,P<0.01).在对节段室壁运动异常的检测中,以冠状动脉造影结果为标准,造影后检测灵敏度、特异度和准确度均高于造影前,分别为73.4％、70％、71.9％ 和 55.2％、45.6％、50.9％(P<0.05).结论:实时超声造影能有效增强左室心内膜边界显示和心肌显影,提高对左室整体和节段心功能检测的准确性.

Abstract:目的:比较靶控输注普鲁泊福复合瑞芬太尼或芬太尼的麻醉深度和术后恢复情况. 方法:90例择期上腹部手术患者,随机分为普鲁泊福-芬太尼A组(PF-A)、普鲁泊福-芬太尼B组(PF-B)、普鲁泊福-瑞芬太尼组(PR),每组30例.普鲁泊福靶浓度均为3 μg /ml;PF-A组芬太尼靶浓度维持2 μg/L;PF-B组芬太尼初始靶浓度为4 μg/L,插管后降为2 μg/L;PR组瑞芬太尼靶浓度为6 μg/L.观察3组患者在麻醉前、气管插管前后、切皮后、术中维持时的平均动脉压(MAP)、心率(HR)、脑电双频指数(BIS),以及患者的麻醉后恢复情况. 结果:PF-A组患者在气管插管后,MAP及HR显著高于插管前(P<0.05),有较明显的插管反应,切皮后各指标与插管前比较无显著差异(P>0.05).PF-B组和PR组患者的各指标在气管插管、切皮后与插管前比较,均无显著性差异(P>0.05).3组患者麻醉和手术期间各时间点BIS值无显著组间差异(P>0.05).此外,PR组患者苏醒时间明显较其他组短. 结论:4 μg/L芬太尼可以有效抑制气管插管反应,而2 μg/L芬太尼则会产生明显的插管反应,但可以有效抑制切皮反应;6 μg/L瑞芬太尼既可以抑制插管反应又可以抑制切皮反应,获得满意的临床麻醉深度.

Abstract:目的:介绍鼻唇沟岛状皮瓣在面部皮肤缺损修复中的应用和效果.方法:自1997年8月至2005年1月,以鼻唇沟区作皮瓣供区,设计推进和易位转移的两种以皮下组织为蒂的鼻唇沟岛状皮瓣,修复面部鼻唇沟周围的中等大小的皮肤缺损共23处,缺损大小由2.0 cm×1.9 cm至5.0 cm×4.5 cm. 结果:皮瓣全部成活,切口Ⅰ期愈合,随访时间1～40个月, 面部形态满意;局部平整,没有"猫耳朵"形成;切口瘢痕隐藏于鼻唇沟皱褶内而不显;面部各器官没有扭曲和移位畸形.结论:鼻唇沟岛状皮瓣是修复面部中等大小皮肤缺损的较可靠和理想的方法之一.

Abstract:目的:通过与常规肺叶、全肺切除术的比较,探讨肺动脉、支气管成形肺切除术的手术适应证.方法:我科1980～2000年间行肺动脉、支气管成形肺叶切除手术的原发性非小细胞肺癌患者64例,其中TNM分期N0期21例, N1期28例, N2期15例.总结此类手术的操作和围手术期处理经验,并按TNM分期比较术后第3、5、10年的生存率.另选取同期常规全肺切除术和常规肺叶切除术患者各64例,比较三种术式术后病死率和并发症率.结果:肺动脉、支气管成形肺切除术组的第3、5、10年生存率分别为58％、42％、19％,中位生存时间为45.76个月,其中21例N0患者的第3、5、10年生存率分别为82％、56％、29％,28例N1患者的第3、5、10年生存率分别为56％、39％、27％,15例N2患者的第3、5、10年生存率分别为21％、12％、0,不同分期间均存在显著差异(P<0.01).肺动脉、支气管成形肺切除术术后病死率及并发症率与同期手术的常规全肺切除术相比无显著差异,但高于肺叶切除术(P<0.01).结论:肺动脉、支气管成形肺切除术扩大了肺癌的手术适应证,提高了术后的生存质量,此类手术主要适合于上叶中央型N0、N1非小细胞肺癌患者,对于N2患者应慎重.

Abstract:目的:设计仿真模型用于大批伤病员后送动力预计及配置优化.方法:分析了目前运力预计方法的不足,引入运筹学中的选址问题,选用应用随机性集合覆盖模型解决后送运力优化配置的理论模型,分析探讨了伤病员后送中的若干不确定因素,包括后送工具的可获得性、后送工具的容量及速度、有效工作时间.根据这些随机变量的特征,确定相应的理论概率分布.结果:按照蒙特卡罗仿真的原理,以随机性集合覆盖模型为基础,用随机数模拟上述不确定因素,形成后送运力优化配置的仿真模型.结论:本模型可作为今后开发计算机辅助软件的基础,并供各级卫勤机构参考.

Abstract:Tuberculosis (TB) is a global burden disease and is being resurrected as a major worldwide public health problem after two decades of neglect.In 1993,the World Health Organization (WHO) declared that TB had been a global emergency because of the scale of the epidemic and the urgent need to improve global tuberculosis control.China is one of the countries with the largest population,and also the top of the 22 TB high-burden countries in the world.In the United States,the longstanding downward trend in TB incidence was interrupted in the mid-to-late 1980s,where the national TB incidence peaked in 1992.Sub-Saharan Africa is one of the three regions to dominate the worldwide distribution of notified TB cases.Of the 15 countries with the highest estimated tuberculosis incidence rates in the world,13 are in sub-Saharan Africa,where HIV is the most important single predictor of tuberculosis incidence.The largest share of the global burden of HIV-related tuberculosis falls on this region.The reasons for the persisting global tuberculosis burden include increased poverty in some regions,immigration from countries with high tuberculosis prevalence,the impact of HIV,and most importantly,the failure to maintain the necessary public health infrastructure under the mistaken belief that tuberculosis was a problem of the past.Relying on currently available methods of diagnosis and treatment,the DOT strategy promoted by the WHO for global tuberculosis control is effective,affordable,and adaptable in different settings.

Abstract:蛇毒金属蛋白酶是蛇毒主要功能性蛋白质之一,它直接作用于局部组织的毛细血管,影响毛细血管内皮细胞与基底膜之间的相互作用;蛇毒去整合素与蛇毒金属蛋白酶来自共同的前金属蛋白酶原,这些酶原都含有4个共同的结构域:信号肽、前导肽、蛋白酶结构域、间隔区.去整合素因能特异性识别整合素而得名,蛇毒去整合素为低分子量蛋白质,含有多个Cys残基,它能阻断整合素与其配体的结合,抑制整合素介导的细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附反应,在血小板聚集、感染、炎症反应、肿瘤转移等病理过程中发挥重要作用.

Abstract:目的:应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术,建立定量检测CK19 mRNA的方法. 方法:采用RT-PCR从胃癌细胞中克隆CK19片段(230 bp),装入pMD 18-T Simple载体.纯化质粒,制备荧光定量PCR标准品.应用LightCycle荧光定量PCR仪检测标准品、30例正常人外周血和5例肿瘤组织CK19 mRNA. 结果:PCR扩增及测序均证实CK19 cDNA片段重组到pMD 18-T载体上,建立了稳定的检测CK19 mRNA的标准,即设定CT值在35个循环之内,检测结果低于100个拷贝数量级为阴性标本.结论:采用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术检测外周血CK19 mRNA是一种稳定可靠的方法.

Abstract:目的:体外分离肾细胞癌原代侵袭性和非侵袭性细胞.方法:消化法或植块法对32例临床新鲜肾细胞癌进行原代培养.在预实验确定铺胶浓度、消化回收时间的基础上,采用涂有Matrigel的Transwell对3例原代培养的肾细胞癌细胞进行体外侵袭实验,分离回收侵袭性和非侵袭性细胞.结果:(1)原代培养成功率为90.6％(29/32).(2)以1.0 mg/ml、20 μl/孔对Transwell铺胶,固定细胞悬液密度(5×105/ml),第5天消化回收细胞较为理想.非侵袭性细胞散在生长,侵袭性细胞多呈克隆样生长.侵袭性细胞倍增时间为36.1 h,非侵袭性细胞为50.6 h.结论:Transwell可体外快速分离及回收、培养不同侵袭性的肾癌原代细胞群.用原代肿瘤细胞进行体外侵袭实验代表性好,但难以突破肿瘤细胞的有限生存期.

Abstract:目的:改良大鼠喉移植模型,提高移植喉的存活率.方法:80只Ⅱ级近交系F344大白鼠,体质量250～350 g,随机分为2组,每组40只,共20对.对照组采用Strome喉移植模型,实验组在切取供体喉时保留咽升动脉,将舌根、喉、喉咽作为复合移植体,供体大鼠双侧颈总动脉分别与受体大鼠颈总动脉、颈前静脉进行端端吻合重建移植喉血液循环,比较两组术后动静脉通畅率及移植喉存活率.结果:Strome模型术后动脉、静脉通畅率和移植喉存活率分别为30％(6/20)、15％(3/20)、30％(6/20),实验组为75％(15/20)、65％(13/20)、80％(16/20),两组比较差异有显著性意义(P<0.05).结论:大鼠喉移植改良模型提高了受体大鼠和移植喉的存活率,优于Strome模型.

Abstract:目的:建立一种快速、高效地从淡豆豉的乙醇提取物中分离3种大豆异黄酮苷的方法.方法:采用索氏提取除去脂溶性成分,再经1300型大孔吸附树脂初步分离纯化,分别用水、10％、20％、30％、40％、50％、70％、95％乙醇梯度洗脱,其中对40％乙醇洗脱流分采用反相高效液相色谱法制备,色谱条件:YWG C18 柱(10.0 mm × 200 mm, 10 μm),进样量750 μl,乙腈-水-冰醋酸(25751,V /V /V)为流动相,流速3.0 ml/min,检测波长260 nm.结果:快速分离得到大豆苷、黄豆苷和染料木苷,经外标法检测,所得化合物纯度均达到99％以上.结论:该方法操作简便,可重复进样,适用于高纯度大豆异黄酮苷的制备.

Abstract:目的:探讨影响红花扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)的各种因素,建立并优化红花AFLP反应体系,为研究红花品质性状的遗传基础及建立分子辅助标记育种的技术平台奠定基础.方法:CTAB法提取红花基因组DNA,用Beckman紫外可见分光光度计测定样品DNA浓度与纯度质量(D值);检测后分别进行一步法酶切与连接,或两步法酶切与连接,以检测哪种方法更适合;酶切连接产物设置不同的稀释倍数(5倍、10倍、15倍、20倍、25倍和30倍)进行预扩增,预扩增产物设置不同稀释倍数(10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍和200倍)进行选择性扩增;选择性扩增产物95℃变性8 min后,用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测.结果:本研究建立适用于红花的AFLP体系:用乙醇沉淀DNA,建立的模板不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseⅠ和EcoRⅠ完全酶切;确定两步法进行酶切、连接,酶切时间为37℃ 3 h,连接16℃过夜,缓冲液采用NEB公司Buffer 2;预扩增产物最佳稀释倍数为25倍;选择性扩增最佳稀释倍数为75倍;上述建立的AFLP反应体系,PAGE电泳中主带清晰,没有降解.结论:本研究建立的反应体系适用于红花基因组DNA的AFLP研究.

Abstract:目的:建立高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)梯度洗脱法测定膜荚黄芪中黄芪甲苷含量.方法:黄芪药材经甲醇-氨水(9:1,V/V)超声提取60 min,确定实验条件并进行方法学考察;色谱条件:依利特Hypersil ODS 2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:A相为乙腈,B相为水,梯度洗脱;流速:1.0 ml/min;柱温:室温;进样量:20 μl.蒸发光散射检测器条件:漂移管温度:40℃,载气(空气)压力:3.5 bar(1 bar＝105Pa),增益值:7.结果:黄芪甲苷的理论塔板数为214 798,分离度为1.858,拖尾因子为1.011.回归方程为Y=1.415 X + 7.509,r=0.999 4,线性范围在6.930～693.0 μg/ml之间.方法学考察结果表明,日内和日间精密度的RSD均小于2.0％,48 h内稳定性试验的RSD分别为1.24％,重复性试验的RSD分别为1.26％(n=5),最低检测限为0.693 0 μg/ml,加样回收率为97.05％,RSD＝0.17％(n=3).膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量均符合<中国药典>标准.结论:该方法缩减了黄芪药材的前处理步骤,测定结果准确,适用于黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的研究.

Abstract:目的:进行黄芪药材中黄芪皂苷Ⅳ的富集纯化工艺研究,为大规模制备黄芪皂苷Ⅳ提供借鉴.方法:建立高效液相色谱-质谱检测器(HPLC-MSD)测定黄芪皂苷Ⅳ含量的方法.对多种不同型号大孔树脂的吸附能力进行了筛选,同时考察确定了其吸附容量;通过对不同比例的乙醇溶液进行最佳洗脱液和洗脱量的选择.结果:HPLC-MSD测定方法学考察结果良好.工艺筛选最终确定吸附能力最强的D101型作为纯化工艺的大孔树脂,同时确定黄芪皂苷Ⅳ的吸附容量为0.42 mg/g,洗脱液为5倍量70％乙醇.结论:D101型大孔树脂对黄芪皂苷Ⅳ的精制程度效果较好,能提高黄芪皂苷Ⅳ的纯度,并为分析总皂苷的组成提供保证.

Abstract:随着社会人口老龄化的出现,脑血管病、阿尔茨海默病等神经系统疾病的发病率正逐渐增加.作为一种理论和方法学基础,系统论在神经系统疾病研究中具有重要作用.本文根据系统论的原则,分别从整体性、层次性与时序性三个层面出发,通过近年神经系统疾病病因学及诊断与治疗等方面研究的相关进展,对神经系统疾病的研究思路作一探讨.

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Abstract:目的:探讨常规体外循环与非体外循环下冠脉旁路移植术(CABG)后肾功能的变化规律. 方法:择期行 CABG术的患者60例,随机分为常规组和非体外循环组,每组30例,分别在体外循环心脏停跳下行冠脉旁路移植术(CCABG)和非体外循环心脏不停跳下行冠脉旁路移植术(OPCAB),并且在术前及术后6、24和48 h测定血肌酐值并计算出肌酐清除率.结果:术后24 h肌酐清除率CCABG组显著低于术前水平(62.7±18.2) ml/min vs (78.8±24.3) ml/min, P<0.05,OPCAB组也显著低于术前水平(72.9±20.5) ml/min vs (81.9±19.7) ml/min, P<0.05,CCABG组显著低于OPCAB组,P<0.05;术后48 h肌酐清除率CCABG组仍显著低于术前水平(68.5±13.2) ml/min vs (78.8±24.3) ml/min ,P<0.05,但OPCAB组已恢复到术前水平.CCABG组肾功能不全(RD)的发生率显著高于OPCAB组(46.7％ vs 20.0％, P<0.05).结论:常规体外循环与非体外循环CABG相比,前者对肾功能的损害较大,术后更易发生肾功能不全.

Abstract:目的:克隆并在大肠杆菌中表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)基因,制备其抗血清.方法:通过PCR方法扩增包含蛋白融合点的PSCA基因片段,经DNA测序证实后克隆至带有Trx.6His标签的原核表达载体pET32a,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,经Ni-NTA树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,ELISA检测抗血清的滴度,免疫组化鉴定其特异性.结果:PCR扩增得到241 bp的目的片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致;成功构建了PSCA基因片段的原核表达载体pET32a-PSCA;在大肠杆菌中表达,于相对分子质量为20.4×103处有一蛋白新生带;PSCA融合蛋白免疫小鼠后,ELISA确认抗血清的滴度>1∶4 000.抗血清检测到前列腺癌组织中PSCA的表达. 结论:成功克隆、表达了人PSCA融合基因片段,并制备了相应的抗血清.

Abstract:目的:筛选预防芥子气皮肤中毒的有效药物.方法:以家兔为动物模型,以空白对照组和软膏基质组为对照,从创面形态学和组织病理学变化来观察分别含有半胱氨酸、甲壳胺、烟酸、EDTA这4种药物成分的软膏制剂对芥子气皮肤染毒的预防作用.结果:从创面形态学看,甲壳胺组、半胱氨酸组比对照组损伤面积小、恢复时间快、毛发再生早;从病理组织学变化看,这两组创面的表皮基底层基本完好,真皮充血、水肿、炎细胞渗出程度相对较轻.结论:甲壳胺和半胱氨酸对芥子气皮肤中毒有一定的保护作用,而烟酸和EDTA的效果不明显.

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