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| 目的 构建Smad泛素调节因子1 (Smurf1) 基因的RNA干扰( RNAi) 慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础。方法 构建Smurf1 基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4 条RNAi片段并构建RNAi 慢病毒载体。过表达质粒和RNAi 质粒共转染293T细胞后应用Western印迹法进行外源筛靶,筛靶出成功的干扰质粒PSC2939。用慢病毒包装PSC2939后感染U20S细胞,进行内源验证,荧光定量PCR和Western印迹检测U20S细胞中Smurf1 mRNA及蛋白的表达。结果 经PCR及测序证实,Smurf1基因过表达载体及4种干扰载体均成功构建；Western 印迹外源筛靶显示,PSC2939干扰载体能有效敲减目的基因的表达；慢病毒包装后的PSC2939干扰载体能有效抑制U20S细胞中Smurf1蛋白的表达,对Smurf1 mRNA的抑制率达到60%以上。结论 成功构建可供感染的Smurf1 基因RNAi 慢病毒载体,为进一步研究Smurf1基因在骨肉瘤细胞中的作用提供了有效的实验工具。 |
| 关键词: RNA 干扰 Smurf1 骨肉瘤 慢病毒属 |
| DOI：10.3724/SP.J.1008.2011.01147 |
| 投稿时间：2011-02-08修订日期：2011-07-25 |
| 基金项目:上海市基础研究重点项目(08JC1406700). |
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| Construction of recombinant lentiviral vector of RNAi targeting Smurf1 gene and its expression in U20S cells |
| YUAN Heng-feng,HE Chong-ru,GAO Jin-wei,XU Wei-dong* |
(Department of Orthopaedics,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China
*Corresponding author.) |
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