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| 【立论依据】 骨质疏松症是以骨量减少和骨的微观结构退化为特征,导致骨的脆性增加以致易于发生骨折的一种全身性代谢性骨病。骨质疏松严重威胁人类健康,且发病率呈逐年上升趋势,目前全世界约有2亿多骨质疏松症患者。目前临床上治疗骨质疏松的化学合成药物存在毒性大、价格昂贵等问题,而天然中草药及其制剂则可以克服上述缺点。淫羊藿(Herba Epimdii)是目前临床上治疗骨质疏松的常用中药,已有研究显示其主要成分淫羊藿甙(Icariine, ICA)具有促成骨分化功能,但具体机制不详。microRNA (miRNA)是一类长度约为20~25 nt、在基因转录后水平发挥调控作用的小分子非编码RNA,它几乎参与生物所有的生理病理过程。作为重要的生物调节分子,miRNA是否参与了ICA促成骨分化过程呢?关于ICA促成骨分化的分子机制的研究,可以为临床上提高淫羊藿治疗骨质疏松的效果提供理论和实验依据。 【设计思路】 首先确定ICA促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量,然后进行差异miRNAs筛选并选取部分差异miRNAs进行验证,最后挑选miR-27a进行深入研究。 【实验内容】 (1)ICA处理时间和剂量的确定:用MTT、real-time PCR确定ICA促MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量。(2)差异miRNAs的筛选:将5 μM ICA处理48 h 的MC3T3-E1 RNA及对照进行miRNA测序和分析。(3)差异miRNAs的验证:挑选15个差异miRNAs用Real-time PCR进行验证(已完成),并从中挑选miR-27a进行深入研究。(4)miR-27a在ICA促成骨分化中的作用及机制:① miR-27a靶基因的预测:运用miRWalk在线工具预测miR-27a的靶基因。② Osterix是miR-27a靶基因的验证:A. 构建含有Osterix 3'UTR以及miR-27a结合位点突变的荧光素酶报告质粒;B. 将miR-27a的mimic或对照和构建的荧光素酶报告质粒共转染HEK 293 T细胞,检测并比较荧光素酶活性;C. 将miR-27a的mimic或对照转染MC3T3-E1细胞,确定miR-27a对Osterix mRNA和蛋白表达的影响。③ miR-27a在ICA促成骨分化中的作用:将miR-27a的mimic、inhibitor和对照分别转染MC3T3-E1细胞,再用ICA处理,然后分别用Real-time PCR和碱性磷酸酶染色确定miR-27a在ICA促成骨细胞分化中的作用。 【材料】 HEK 293-T、MC3T3-E1细胞;pGL3-promoter荧光素酶报告基因载体、Real-time PCR用引物及试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体;碱性磷酸酶染色用试剂。 【可行性】 我们具备本课题实施所需要的研究材料包括试剂和仪器;课题设计所用的方法均为指导教师课题组常用的方法;本课题已顺利实施,我们目前已完成了ICA处理时间和剂量的确定、差异miRNAs的筛选和鉴定、miR-27a靶基因的预测。以上实验的实施和结果的获得表明本课题在理论和技术上均可行。 【创新性】 (1)首次证明miRNAs参与ICA促成骨细胞分化过程;(2)首次证明miR-27a 在ICA促成骨细胞分化中起重要作用。研究结果将进一步阐明ICA促成骨细胞分化的分子机制,从而为提高淫羊藿的临床治疗效果提供理论和实验依据。 |
| 关键词: 淫羊藿甙 成骨细胞 分化 microRNA |
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