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| 【立论依据】 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种革兰氏阴性球杆菌,是引起院内感染的主要菌种之一,多重耐药和泛耐药AB菌株感染更是给临床治疗带来极大的困难。生物被膜形成能力与AB耐药以及致病性密切相关。寻找AB生物被膜形成的关键基因对于AB相关疾病的预防和控制具有重要意义。转座子是一段特殊的DNA片段,在转座酶的作用下,可随机插入细菌基因组,使插入基因失活,改变相关表型。应用转座子随机突变策略可以找出特定表型对应的基因,但是以传统的抗生素抗性基因作为报告基因显然不能满足对多重耐药菌株的研究。 【设计思路】 绿色荧光蛋白(GFP)因为不需要单独加入底物并且易于观察而被广泛用来标记生物分子或细胞。已有研究表明,GFP基因插入细菌的染色体上后,可以有效地对细菌进行标记。基于转座质粒以及GFP的特点,本研究拟构建具有Tn5转座子和GFP基因的pTn5GFP转座质粒,利用GFP作为报告基因,构建临床分离的多重耐药AB突变文库,进而筛选出AB生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【实验内容】 以pGFPmut3.1质粒为模板,扩增GFP基因,将其连接入含有Tn5转座子的pRL27质粒,构建pTn5GFP转座质粒。利用该质粒对多重耐药AB菌株进行转座子突变,构造突变文库。对突变株的生物被膜情况进行分析,确定转座子插入位点,找出生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【材料】 临床多重耐药AB两株,R005和R036,自北京大学人民医院获得。常用工具菌E.coli CC118λπ和E.coli DH5α。pRL27和pGFPmut3.1质粒由原实验室毕业研究生提供。 【可行性】 已成功构建了pTn5GFP转座质粒,该质粒在容纳菌株E.coli CC118λπ具有绿色荧光表型,并已通过预实验初步确定了两株多重耐药AB生物被膜形成能力和最适实验条件。 【创新性】 本研究将GFP报告基因的便捷性以及转座质粒的转座性结合起来,有效解决了因耐药性而无法对泛耐药菌株构建突变文库的问题,结果直观,易于筛选,可行性高。 |
| 关键词: 转座子 GFP 多重耐药菌 鲍曼不动杆菌 生物被膜 |
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