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| 【立论依据及设计思路】 已有研究表明在人肝癌组织中,间质细胞的线粒体会在癌细胞的驱动下会发生线粒体自噬,只进行糖酵解,且糖酵解相关酶的表达水平显著升高,尤其是间质细胞特异高表达LDHA(乳酸脱氢酶A),将糖酵解产物丙酮酸转化成乳酸,排出间质细胞。而排出的乳酸被邻近的肝癌细胞摄取,肝癌细胞特异表达LDHB,将乳酸转变成丙酮酸。肝癌细胞具有完整的氧化磷酸化过程,能利用间质细胞提供的乳酸,经三羧酸循环、糖异生和脂肪合成,为肿瘤细胞的增殖提供物质和能量。间质细胞的糖酵解和肿瘤细胞的氧化磷酸化之间代谢偶联,是维持肿瘤细胞快速增殖的重要机制。前期实验发现肝癌细胞表达膜型LDHB,而膜型LDHB的功能尚不清楚。本课题拟研究LDHA和LDHB在人肝癌间质细胞和肝癌细胞中的表达和定位和酶学特征,阐述LDH在肝癌组织能量代谢偶联过程中的生化机制,同时评价LDH作为人肝癌能量代谢干预靶点的可能性。 【实验内容】 第一部分:人体肝癌组织标本中肝癌细胞和间质细胞线粒体功能和反向Warburg效应的检测,利用免疫组化的方法检测线粒体标志物和线粒体自噬标志物及LDHA和LDHB的表达分布;第二部分:建立肝癌细胞SMMC-7721和正常人成纤维细胞的共培养体系;第三部分:检测LDH在肝癌细胞及肝癌相关成纤维细胞中的膜定位及表达水平;第四部分:对细胞膜上的LDH进行酶活性检测,明确其酶活性和代谢特征;第五部分:在细胞水平上研究LDH抗体,抗寄生虫药,单羧酸转运体抑制剂对能量代谢偶联的抑制作用;第六部分: 裸鼠模型的抗体和阿苯达唑的抗肿瘤实验。 【材料】 人肝癌SMMC-7721细胞株及成纤维细胞株,特异性LDH抗体,抗寄生虫药物(吡喹酮,阿苯达唑),免疫组化相关材料,qPCR相关材料,免疫印迹相关材料,MTT比色法相关材料。 【可行性】 本实验室已完成了人LDHA和LDHB的克隆表达和酶学特性研究,已实验证实人肝癌细胞SMMC-7721只表达LDHB, 且定位于细胞膜上。 【创新性】 提出肝癌组织中,间质细胞和实质细胞分别表达膜型LDHA和LDHB,不仅负责丙酮酸和乳酸之间的相互转化,而且可能是产物的转运体;抗寄生虫LDH的抗体和药物可以抑制人LDH的酶活性,抑制肿瘤的生长和转移。 |
| 关键词: 肝癌 乳酸脱氢酶 抗寄生虫药 |
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