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| 【目的】 亨廷顿病(HD)基因突变后编码的突变亨廷顿蛋白(mHtt)通过干扰神经元的细胞周期,造成神经元死亡;钙反应性反式激活子(CREST)可促进神经元分化发育。本项目研究mHtt是否通过影响CREST而产生细胞毒性。 【方法】 应用免疫印迹、RT-PCR检测HD转基因小鼠(R6/2小鼠)和转染表达mHtt的小鼠成神经瘤细胞(N2a细胞)中CREST的蛋白和mRNA水平,应用生物信息学方法和缺失突变实验分析检测CREST中可能酶解位点,应用台盼蓝和PI染色检测细胞活力,以无血清培养进行神经细胞分化诱导,以N2a细胞突起生长长度反映其分化能力。 【结果】 在HD转基因小鼠大脑皮质、纹状体、海马内及转染表达mHtt的N2a细胞内,CREST蛋白水平明显降低,但其mRNA水平无显著改变,提示mHtt不影响CREST的转录表达,但可引起CREST翻译后水平的改变。在全长CREST(55 kDa)蛋白水平降低的同时,一个分子量在35 kDa左右的CREST裂解片段水平显著增加。生物信息学分析发现,CREST分子中不存在半胱氨酸蛋白酶(caspase)酶切位点,但存在多个可能的钙蛋白酶(calpain)酶切位点。在表达mHtt的N2a细胞用calpain活性抑制剂calpeptin处理后,35 kDa-CREST片段的产生减少,而全长CREST水平的降低被抑制。分别用HA和Flag标签对全长CREST蛋白的氨基端和羧基端进行标记,构建了HA-CREST-flag质粒,与表达mHtt的质粒共转N2a细胞后,发现35 kDa-CREST片段可以被Flag抗体检测到,而不能被HA抗体检测到;缺失132-139aa的CREST在表达mHtt的细胞中产生与对照细胞水平相近的35 kDa羧基末端片段,而其他缺失钙蛋白酶可能裂解位点的CREST在表达mHtt的细胞中仍产生高水平的35 kDa羧基末端片段。因此,被mHtt激活的钙蛋白酶主要在CREST的132-139aa部位对其进行裂解。对细胞活力的分析发现,在转染表达mHtt的N2a细胞中,过表达CREST可以显著降低台盼蓝和PI染色阳性的死细胞比率;过表达CREST还可显著纠正mHtt对N2a细胞突起生长的抑制。细胞活力分析和突起生长检测结果提示,mHtt对细胞的毒性和对分化的抑制与其降低CREST蛋白水平有关。 【结论】 mHtt在CREST 132-139aa处通过钙蛋白酶相关的蛋白裂解方式促进CREST的降解,引起CREST促神经元分化功能的降低而产生细胞毒性。该研究进一步揭示了HD的病理学机制,并为探索治疗HD的方法提供了新的线索。 |
| 关键词: 亨廷顿病 亨廷顿蛋白 钙反应性反式激活子 钙蛋白酶 神经元分化 |
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