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| 【目的】 当机体代谢生成的活性氧簇超过了抗氧化系统的清除能力,可引起氧化应激而与心血管疾病、炎症、肿瘤等发生密切相关。甲硫氨酸亚砜还原酶A (methionine sulfoxide reductase A, MsrA)能够特异还原被氧化的甲硫氨酸, 是细胞内一道重要的蛋白抗氧化防御屏障。导师课题组曾构建大肠杆菌表达系统并获得人源性MsrA(hMsrA),证实其在体外的抗氧化作用。本课题试图利用酵母表达体系表达一种具有细胞穿膜活性的分泌型Pep-1-hMsrA,为进一步研究 MsrA 对细胞的抗氧化保护机制奠定基础。 【方法】 利用基因克隆技术,合成含有细胞穿膜肽的pUC19/pep-1载体,双酶切将Pep-1序列连接到pET28a/hMsrA质粒上,构建pUC19/pep-1-hMsrA,再双酶切亚克隆到酵母表达载体获得pPICZ9k/pep-1-hMsrA重组质粒。经线性化的质粒电转化导入毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选、PCR鉴定拷贝数,构建新的hMsrA酵母表达体系。经甲醇(0.5%V/V)诱导表达,SDS-PAGE鉴定发酵液中Pep-1-hMsrA融合蛋白的产量,利用Ni-NTA Agarose亲和层析分离纯化目的蛋白,蛋白质印迹法鉴定融合蛋白的细胞穿膜效率,利用特异荧光底物鉴定融合蛋白的催化活性。 【结果】 成功构建pPIC9k/Pep-1-hMsrA重组质粒,并筛选出17株表达Pep-1-hMsrA的GS115工程株。诱导表达并纯化的目的蛋白产量约为30~40 mg/L,SDS-PAGE显示MW为约50 kD的单一条带,糖染色表明目的蛋白糖基化。蛋白质印迹法鉴定纯化蛋白有免疫原性,并具有特异还原活性。 【结论】 建立了Pep-1-hMsrA重组蛋白的酵母表达体系,纯化的Pep-1-hMsrA存在高度糖基化可能影响其催化活性,有待进一步研究此MsrA融入蛋白的结构与功能。 |
| 关键词: 甲硫氨酸亚砜还原酶A 细胞穿膜肽 毕赤酵母表达体系 纯化 |
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