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| 【目的】 本实验旨在探究microRNA参与调控E3大鼠高脂饮食诱导的代谢综合征(HFD-MetS)模型肝胰岛素受体(InsR)表达下降的分子机制。 【方法】 首先根据microRNA数据库预测并选择可能调控InsR表达的候选microRNAs, 用实时定量PCR法检测E3大鼠HFD-MetS模型肝中这些候选microRNAs的表达水平,选择与InsR mRNA表达呈负相关的关键microRNA。然后用该关键microRNA的模拟物和抑制剂瞬时转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919细胞24 h。无血清培养基培养4 h后,用100 nmol/L的胰岛素分别处理上述细胞0、5、15 min,用实时定量 PCR和蛋白质印迹检测InsR、AKT及磷酸化AKT的表达。最后,分别构建包含miR-497结合位点和突变结合位点的、野生型和突变型的胰岛素受体 mRNA 3'UTR区双荧光素酶报告基因载体(简称为野生型载体和突变型载体),用miR-497模拟物和抑制剂分别与空载体、野生型载体、突变型载体转染293T细胞、观察萤火虫/海肾虫荧光强度比值的相对改变。 【结果】 实时定量PCR及相关分析结果显示miR-497在E3大鼠HFD-MetS模型肝中表达显著上调,并与InsR 表达水平呈负相关。用miR-497模拟物瞬时转染CBRH-7919细胞24 h,InsR的mRNA和蛋白质表达水平与对照组相比显著下降,胰岛素处理5、15 min后在ser473 和Thr308位点磷酸化的AKT 与对照组相比也明显下降;而miR-497抑制剂瞬时转染后,InsR的mRNA和蛋白质及胰岛素处理后ser473 和Thr308位点磷酸化的AKT与对照组相比明显上调,这些结果说明miR-497负性调节了胰岛素受体表达。最后用miR-497模拟物分别与空载体、野生型载体及突变型载体转染293T细胞后,与空载体组相比,野生型载体组相对的萤火虫/海肾虫荧光强度比值明显下降,突变型载体组无变化,而用miR-497抑制剂分别与上述三种载体转染293T细胞后,野生型载体组结果恰相反、突变型载体组亦无变化;这些结果进一步提示miR-497可直接与大鼠InsR mRNA的3-UTR区结合。 【结论】 在E3大鼠HFD-MetS模型肝中上调的miR-497可能通过抑制胰岛素受体的表达而导致肝胰岛素抵抗的发生。 |
| 关键词: miR-497 胰岛素受体 肝胰岛素抵抗 E3大鼠 HFD-MetS模型 |
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