【目的】 观察不同剂量咖啡因对大鼠神经行为学与海马形态学及神经元内γ-氨基丁酸(GABA)和5-羟色胺表达的影响,以探讨咖啡因改善学习记忆能力的可能作用机制。 【方法】 将30只雌性SD大鼠按完全随机分组法分成3组,对照组(n=10)每天给予生理盐水灌胃,实验组分低剂量组(n=10)和高剂量组(n=10),每天分别给予 20、60 mg/kg咖啡因灌胃,连续18 d,进行咖啡因干预处理。通过Morris水迷宫实验测试各组大鼠的学习记忆能力,运用免疫组织化学方法检测各组大鼠海马神经元内GABA和5-羟色胺表达变化,借助H-E染色、尼氏染色和电子显微镜观察各组大鼠海马神经元形态结构改变。 【结果】 Morris水迷宫实验结果显示咖啡因可以改善大鼠学习记忆能力,高剂量咖啡因作用更加显著,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色显示高剂量组(0.214 1±0.006 6)和低剂量组(0.279 4±0.008 1)海马神经元内GABA表达较对照组(0.355 1±0.011 7)减少(F=172.603,P<0.05);高剂量组(0.551 3±0.017 8)和低剂量组(0.485 6±0.008 5)5-羟色胺表达较对照组(0.290 3±0.009 7)增多(F=289.541,P<0.05),且高剂量组变化更加明显;H-E染色未见异常;尼氏染色显示高剂量组(0.559 8±0.009 5)和低剂量组(0.575 9±0.004 9)海马神经元内尼氏体较对照组(0.385 3±0.008 1)增多(F=31.776,P<0.05),且低剂量组增多更加显著;电镜观察发现实验组海马神经元内游离核糖体密度较对照组明显增高,高剂量组海马部分神经元局部内质网轻度扩张、线粒体肿胀、神经髓鞘松解受损。 【结论】 在一定剂量范围内,咖啡因可剂量依赖性地改善大鼠学习记忆能力,其作用机制可能与抑制海马神经元内GABA表达和促进5-羟色胺表达有关。]]> 2014/12/11 10:03:21 164true 【目的】 通过临床问卷调查和实验动物模型探讨辣椒素是否对缺血性脑卒中有保护作用。分析食用辣椒是否会影响缺血性脑卒中的发生以及患者的疾病严重程度,观察辣椒素灌胃处理是否影响大鼠的神经学功能评价和脑缺血情况,从而分析辣椒素对缺血性脑卒中是否存在保护效应。 【方法】 临床问卷调查:选取缺血性脑卒中患者和无心脑血管疾病人群各600例,发放问卷进行调查,之后进行病例对照分析,统计两组人群在是否食用辣椒、食用辣椒的频率及种类等方面的差异;动物实验:采用大鼠大脑中动脉阻塞模型,结合神经学功能评价和TTC染色技术观察辣椒素灌胃处理对大鼠缺血性脑卒中是否存在保护效应。 【结果】 通过统计临床调查得到的问卷数据,分析对照组和病例组在是否食用辣椒以及食用辣椒的频率、种类等方面的差异,相比病例组而言,对照组食用辣椒的频率要更高,种类更丰富,更偏向于辣度高的辣椒。统计TTC染色后的脑片,统计缺血面积的大小,结果显示术前给予辣椒素后,脑缺血面积显著降低。同时取实验组大鼠的胃部组织进行切片观察,在权衡脑缺血损伤保护效应和胃部损伤效应后,得到灌胃的最佳剂量为120 mg/kg。 【结论】 综合临床和动物实验两部分研究结果表明,食用辣椒可在一定程度上预防缺血性脑卒中的发生。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,朱肖琪²,董一言²;指导教师:王韵]]> 163true 【目的】 联合型运动性学习(associative motor learning)是人类从事生产劳动和体育活动所必需的重要脑高级功能,它需要通过分别执行感觉和运动信息处理的脑区之间的协作来实现。例如,在痕迹性眨眼条件反射任务中(一种研究联合型运动性学习神经机制的行为模型),为恰当地表现出运动性学习行为,内侧前额叶皮层必需编码和保持感觉刺激信息,然后再与小脑进行相互作用。但是,这两个远距脑区之间相互协作的机制目前仍不清楚。 【方法】 同步记录正在执行痕迹性眨眼条件反射任务的豚鼠尾端内侧前额叶皮层和小脑的局部场电位(local field potential,LFP)活动,并利用SB-334867干扰内源性觉醒肽orexins对小脑的兴奋作用,观察上述脑区之间LFP振荡同步化和条件眨眼反应适应性表现的变化。 【结果】 在痕迹性眨眼条件反射任务执行过程中,给予2 kHz纯音条件刺激会使尾端内侧前额叶皮层和小脑之间出现明显的LFP振荡同步化,而且该振荡同步化特异出现在theta频带(5.0~12.0 Hz),而不是发生在delta频带(0.5~4.5 Hz)和beta频带(12.5~30.0 Hz)。更重要的是,适应性条件眨眼反应特异出现在两个脑区间theta振荡同步化水平较高的条件下。这种更高的同步化水平是源于两个脑区之间LFP信号规律性排列(P<0.05),而非由两个脑区之间LFP信号功率强度相关度增加所引起(P>0.05)。此外,尾端内侧前额叶皮层与小脑theta振荡同步化和条件反应适应性表达的相关只在学习早期阶段是显著的(P<0.05),而在学习后期阶段该相关性则未达到显著水平(P>0.05)。最后,干扰内源性觉醒肽orexins对小脑的兴奋作用,会使尾端内侧前额叶皮层与小脑之间的theta振荡同步化水平显著降低,且这种降低与条件眨眼反应的适应性表现损害效应呈现明显的正相关(P<0.05)。 【结论】 内侧前额叶皮层可以通过theta频带振荡同步化的方式与小脑进行相互协作,从而有助于两个脑区间的信息传递以及运动性学习行为的正确表现。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,赵倩文²,胡陈³;指导教师:王韵]]> 162true 【目的】 机械压迫背根神经节及其附近的神经根可能会引起腰痛和坐骨神经痛,而在患者人群中多节段的腰骶神经根病比单一能级水平更常见,常常表现出多节段神经根受压和椎间孔狭窄。本研究目的是观察多节段背根神经节慢性压迫(mCCD)模型大鼠自发和诱发痛行为,初步探讨其可能的神经机制。 【方法】 将168只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(200~220 g)随机分成多节段背根神经节慢性压迫(n=89)组和正常(正常对照,n=79)组。本实验自发痛行为由位于大鼠视野盲区的摄像头记录,机械和温度(冷和热)刺激诱发痛行为进行评估。采用免疫组织化学和多导微电极阵列方法观察mCCD组大鼠外周背根神经节和中枢神经系统前扣带回皮层的可塑性变化。 【结果】 mCCD模型大鼠在术后3 h~42 d中表现出持续和明显的自发痛行为,如湿狗样行为和自发性缩爪,在术后1~42 d中出现明显同侧和对侧机械性触诱发痛和痛觉过敏、冷和热痛觉异常行为,热痛觉过敏。在mCCD模型大鼠同侧及对侧背根神经节中神经损伤标志物激活转录因子3(ATF3)的表达明显增加,ATF3表达增加出现于所有大小的背根神经节神经元中,同时对侧和同侧前扣带回皮层的长时程增强(LTP)消失。 【结论】 mCCD大鼠出现自发痛行为和对侧机械、温度性痛觉敏化,双侧背根神经节神经元损伤和前扣带回皮层突触可塑性变化可能参与该模型双侧机械和温度性痛觉敏化以及自发痛行为。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,宋凯²,杨雨洁²,何阳菘²;指导教师:徐晖]]> 161true 【目的】 文献表明NF-κB活化可上调Cyclin D1,异常启动细胞周期诱导神经细胞凋亡。课题组前期研究发现氯胺酮能上调未成熟神经细胞Cyclin D1的表达,且呈时间剂量依赖性,提示NF-κB在氯胺酮诱导未成熟神经毒性方面起重要作用。本研究通过体内和体外模型观察氯胺酮诱导的未成熟神经细胞凋亡过程中NF-κB活性的变化,探讨NF-κB在其过程中的作用。 【方法】 体内模型: P7SD幼鼠每90分钟经腹腔注射不同剂量的氯胺酮 (0、5、10、20 mg/kg)共5次,7.5 h后提取大脑皮质细胞浆蛋白及核蛋白。体外模型: E18胎鼠皮质神经细胞培养24 h,加入不同浓度的氯胺酮(0、1、10、100、1 000 μmol/L),作用不同时间(6、12、24、48 h)提取大脑皮质细胞浆蛋白及核蛋白。MTT法检测氯胺酮对E18胎鼠皮质神经细胞体外存活率的影响;蛋白质印迹法检测P7幼鼠皮质及E18胎鼠皮质神经细胞中核蛋白P65、P50和浆蛋白I-κB的表达水平。 【结果】 MTT法显示在体外模型中氯胺酮作用6 h后实验组神经细胞存活率与对照组无明显差异,作用12 h后100、1 000 μmol/L实验组神经细胞存活率低于对照组,作用24 h后10、100以及1 000 μmol/L实验组神经细胞存活率明显低于对照组,作用48 h后实验组神经细胞存活率均明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹结果显示在体内模型中10、20 mg/kg实验组细胞核中P65蛋白水平明显高于对照组,20 mg/kg实验组细胞核中P50蛋白水平高于对照组,10、20 mg/kg细胞浆中I-κB蛋白表达水平明显低于对照组。 体外模型中氯胺酮处理6、12、24、48 h的100、1 000 μmol/L实验组以及48 h后10 μmol/L实验组细胞核中P65水平高于对照组, 12、24、48 h的100、1 000 μmol/L实验组以及48 h的10 μmol/L实验组细胞核中的P50水平高于对照组,12 h的100、1 000 μmol/L实验组以及24、48 h的10、100、1 000 μmol/L实验组细胞浆中的I-κB表达水平低于对照组,以上实验组与对照组的差异都具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 在一定的剂量作用一定的时间情况下氯胺酮可以诱导未成熟神经细胞凋亡,其可能的机制之一是氯胺酮激活NF-κB,活化NF-κB迅速转移到细胞核内促进Cyclin D1表达,导致细胞周期异常启动从而导致神经细胞凋亡。]]> 2014/12/11 10:03:22 160true 【目的】 研究黄芪的主要有效成分黄芪甲苷和三七的主要有效成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1配伍对小鼠脑缺血再灌注后脑组织能量代谢的影响。 【方法】 C57BL/6小鼠随机分组,连续给药3 d,末次给药1 h后,结扎双侧颈总动脉造成脑缺血20 min,再灌注24 h。用高效液相色谱法(HPLC)测定脑组织中ATP、ADP、AMP含量,计算总腺嘌呤核苷酸(TAN)、能荷(EC)值; RT-PCR法测定葡萄糖转运蛋白(GLUT3) mRNA表达,蛋白质印迹法测定脑组织磷酸化的单磷酸腺苷激活的蛋白激酶α1/2 (p-AMPK α1/2)、GLUT3蛋白表达。 【结果】 (1)黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1可显著增加缺血再灌注后脑组织ATP、ADP、AMP含量,提高TAN值;黄芪甲苷+人参皂苷Rg1、黄芪甲苷+人参皂苷Rb1、黄芪甲苷+三七皂苷R1及四种有效成分配伍均可显著提高脑组织ATP、ADP、AMP含量及TAN、EC值,且两种有效成分配伍的效应强于各有效成分单用,四种有效成分配伍的效应强于各有效成分单用及大部分两有效成分配伍。(2)黄芪甲苷、三七皂苷R1、四种有效成分配伍组、黄芪甲苷+人参皂苷Rg1及黄芪甲苷+三七皂苷R1能显著增加缺血再灌注后脑组织p-AMPK α1/2蛋白表达,且四种有效成分配伍,黄芪甲苷与人参皂苷Rg1、三七皂苷R1配伍升高p-AMPK α1/2的效应分别高于各有效成分单用,四种有效成分配伍组的效应高于黄芪甲苷+人参皂苷Rb1组。(3)脑缺血再灌注后,各药物均能提高脑组织GLUT3基因和蛋白表达,且黄芪甲苷与人参皂苷Rg1和三七皂苷R1两药或四种有效成分配伍增强GLUT3表达的效应大于各有效成分单用;四种有效成分配伍上调GLUT3 mRNA表达的效应大于黄芪甲苷+人参皂苷Rb1配伍,上调GLUT3蛋白表达的效应大于黄芪甲苷+人参皂苷Rb1及黄芪甲苷+三七皂苷R1。 【结论】 黄芪和三七的四种主要有效成分配伍对脑缺血再灌注后脑组织能量代谢的改善具有促进作用,其机制可能与上调脑组织AMPK磷酸化水平,增强脑组织GLUT3蛋白表达,从而介导葡萄糖进入神经细胞,增加神经细胞的葡萄糖供应和摄取,改善缺血后脑组织的能量代谢有关。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,丁煌²,吴东升³,乔宁⁴,张彧⁵;指导教师:黄小平, 李玲]]> 159true 【目的】 阐明Sim2在高糖所致中枢神经系统神经元损伤中的作用,并探讨姜黄素是否能通过降低Sim2的表达在高糖所致神经元损伤中起神经保护作用。 【方法】 将成年Sprague-Dawley鼠随机分成对照组和链脲霉素诱导的糖尿病(DM)组,分别测定血糖含量,血糖超过16.7 mmol/L即为高糖模型鼠。取孕17~18 d胎鼠皮质,原代培养神经元,随机分为对照组(25 mmol/L糖)、高糖组(50 mmol/L糖)、甘露醇组(25 mmol/L甘露醇)、高糖+低剂量姜黄素(0.1 μmol/L)组、高糖+高剂量姜黄素(1 μmol/L)组,分别采用免疫荧光染色以及蛋白质印迹法测定Sim2与Drebrin的含量,用LDH的释放评价细胞活力,定量反转录PCR分析Drebrin的mRNA水平。同时利用表达Sim2 shRNA慢病毒感染培养的神经元,碘化丙啶(PI)染色分析敲低Sim2对细胞损伤的影响。 【结果】 链脲霉素诱导的DM组血糖水平明显升高,表明造模成功。蛋白质印迹结果表明,与对照组相比,Sim2在DM组皮质表达明显升高(P<0.05),而Sim2负性调控的Drebrin蛋白则显著降低(P<0.05)。免疫双标染色结果显示,Sim2主要在神经元中表达。同样,在原代培养的神经元中高糖可诱导Sim2的表达,降低Drebrin的表达。而神经保护剂姜黄素可以降低高糖所致的Sim2表达。LDH结果显示,神经保护剂姜黄素亦减轻高糖所致的神经元损伤。PI染色结果显示,在神经元中敲低Sim2的表达可直接降低高糖所致的神经元损伤。 【结论】 Sim2介导了高糖所致的神经元损伤,且姜黄素可通过降低Sim2的表达发挥其神经元保护作用。该研究为阐述糖尿病脑病的发生和发展提供了新的理论基础。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,陈璐²,庄国兵¹;指导教师:孟宪芳]]> 158true 【目的】 探讨番茄红素对同型半胱氨酸诱导阿尔茨海默病(AD)样病理损伤的保护作用及机制。 【方法】 通过给予同型半胱氨酸 (Hcy,每日尾静脉注射400 μg/kg,连续14 d)制造AD样记忆障碍的大鼠模型,并检测同时补充番茄红素(Lyco,每日灌胃给药40 mg/kg,连续14 d)后相关指标的变化。采用Morris 水迷宫系统测试大鼠的空间记忆能力;运用离体脑片LTP技术比较EPSP的斜率变化,高尔基染色法进行树突棘的形态观察和分析;免疫印迹测定tau的磷酸化水平以及蛋白免疫印迹检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的相关位点及亚基活性。 【结果】 Morris 水迷宫从第5天开始,与正常组(Con)相比,Hcy处理的大鼠(Hcy)显示出潜伏期的延长,而同时补充番茄红素的大鼠(Hcy+Lyco)则显示出正常的缩短的潜伏期,第8天撤走平台进行测试,发现Hcy组大鼠表现出了较长的潜伏期、较少的目标平台穿越次数以及目标象限停留时间。离体脑片LTP记录Hcy组和Hcy+Lyco组大鼠fEPSP的斜率分别增加了约1.2倍和1.6倍,高尔基染色方法观察发现Hcy组的大鼠脑片中,CA1区神经元树突棘密度和成熟的蘑菇型树突棘均出现了减少,而补充番茄红素能够恢复这种改变。在海马组织提取物中,Hcy组大鼠 tau的磷酸化水平在Ser214的(PS214)、Thr231(PT231)、Ser262(PS262)和Ser396(PS396)均出现明显的增加,而非磷酸化的tau(Tau1)的水平则出现了下降,当同时补充番茄红素时,上述表位的过度磷酸化均出现了明显的下降。通过蛋白免疫印记检测到Hcy注射的大鼠海马组织匀浆中,PP2AC在Tyr307的磷酸化和Leu309的去甲基化都出现了增加,而补充番茄红素能够对抗这些变化。 【结论】 番茄红素可有效减轻Hcy诱导的严重记忆损害,有效逆转Hcy诱导的突触传递缺陷,其还可以降低Hcy诱导的PP2AC的磷酸化和去甲基化,并可能进而影响了AD样的tau蛋白磷酸化。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,刘轶凡¹,苏鹏²;指导教师:朱铃强]]> 157true 【目的】 研究高频电磁辐射致大鼠海马区域损伤的机制,探讨高频电磁辐射引起细胞凋亡的规律及安多霖对高频辐射大鼠学习记忆损伤的防治作用,为电磁辐射防护提供理论依据。 【方法】 鼠龄8周健康SD大鼠120只,随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、安多霖低浓度组(C组)、安多霖高浓度组(D组),每组30只。饲养7 d使其适应环境,A和B组生理盐水灌胃,C组给安多霖2 g/(kg·d)灌胃,D组给安多霖4 g/(kg·d)灌胃。给药第10天,对B、C、D组大鼠进行高频辐射,建立动物模型。利用Morris水迷宫,观察高频辐射后大鼠学习记忆能力的变化。在辐射后6 h和24 h,取材,采用SP法检测海马组织中锥体细胞和齿状回颗粒细胞caspase-3蛋白表达情况。采用透射电镜技术检测海马组织中BBB结构的变化。 【结果】 B组与A组相比,B组大鼠行动迟缓,较A组出现对各组刺激反应迟钝的现象。Morris水迷宫检测:高频辐射后,B组大鼠平均逃避潜伏期比A组明显延长,且跨越平台的次数比A组明显减少。透射电镜观察:C组,TEM下可见硝酸镧颗粒主要沉积在毛细血管内皮细胞(BCECs)紧密连接(TJ)处,少量镧颗粒穿过TJ处。星形胶质细胞周围亦见少量镧颗粒沉积。D组,TEM下可见硝酸镧颗粒主要沉积在基膜外侧,未穿过TJ处。星形胶质细胞周围亦未见有镧颗粒沉积。免疫组化检测:C组与B组相比caspase-3表达量低于B组(P<0.05),D组与B组相比caspase-3表达量低于B组(P<0.05),D组与C组相比caspase-3表达量较C组低(P<0.05)。 【结论】 高频辐射通过改变BBB通透性、增高锥体细胞和颗粒细胞中的caspase-3表达、影响大鼠的学习记忆能力。安多霖通过改善大鼠BBB通透性、降低caspase-3表达等途径对高频辐射致大鼠学习记忆能力具有防治的作用。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,张洋洋¹,张焱喆¹,李晓毓明¹,宫天宇²,曹启搏²,李佳楠²,罗雯²;指导教师:朱铃强]]> 156true 【目的】 观察人参皂苷Rg1对Aβ-淀粉样蛋白1-40致阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型大鼠学习记忆能力的影响及对caspase-3表达的调控作用,探究人参皂苷Rg1对海马CA1区神经元凋亡的防护作用。 【方法】 选取3个月龄健康SD大鼠75只,随机分为青年组、假手术组、模型组、人参皂苷Rg1干预组[模型+人参皂苷Rg1 20 mg/(kg·d)剂量组和模型+人参皂苷Rg1 40 mg/(kg·d)剂量组],每组15只。D-半乳糖50 mg/kg大鼠腹腔注射,连续注射6周后,依照Paxions《大鼠脑立体定位图谱》,在海马区注入凝聚态Aβ1-40溶液1 μL制作AD模型。造模成功后,人参皂苷Rg1干预组分别给予人参皂苷Rg1 20、40 mg/(kg·d)灌胃,其它三组以等量生理盐水灌胃(1次/d),连续30 d后利用Morris水迷宫观察人参皂苷Rg1对AD大鼠学习记忆能力的影响;断头取海马,应用H-E染色法观察海马CA1区病理学改变;应用RT-PCR、免疫组化(SABC)和蛋白质印迹法检测caspase-3基因及蛋白表达情况。 【结果】 (1)人参皂苷Rg1干预组大鼠的学习记忆成绩优于模型组(P<0.05);(2)模型组海马CA1区神经元排列欠规则,可见肿胀的细胞,出现核固缩,锥体细胞较少,可见凋亡小体。人参皂苷Rg1干预组可见细胞排列基本规则,明显坏死的锥体细胞较少;(3)与青年组比较,模型组大鼠海马组织caspase-3基因及蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,Rg1干预组大鼠的caspase-3基因及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。 【结论】 人参皂苷Rg1通过抑制caspase-3的表达,从而抑制Aβ1-40致AD模型大鼠神经元凋亡,进而改善AD大鼠学习记忆能力,达到防治AD的目的。]]> 2014/12/11 10:03:22 155true 【目的】 本课题拟通过单侧前脑内侧束注射鱼藤酮(复合物I抑制剂)建立大鼠帕金森病(PD)模型,通过尾静脉注射给药后观察吡咯喹啉醌(PQQ)的保护作用及相关机制,为将其开发为防治PD的药物提供可靠的基础实验依据。 【方法】 建立大鼠鱼藤酮左侧MFB注射模型(坐标:前囟后2.8 mm,中线左旁开2.0 mm,硬膜下8.0 mm),注射12 μg,体积4 μL,速度0.5 μL/min,注射完毕后留针5 min,缓慢退针。鱼藤酮注射后第2天开始通过尾静脉注射给予不同剂量PQQ,在手术后8周通过阿扑吗啡(apomorphine)诱导的旋转实验等观察PQQ对PD模型鼠行为学指标的影响;通过TUNEL和尼氏染色分析大脑皮层和黑质纹状体部位细胞凋亡的情况;采用caspase酶活性分析测定酶活性,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达变化;分离胞质蛋白和线粒体蛋白,检测CytC和Smac的亚细胞定位改变以及线粒体呼吸链复合物活性;通过实时定量PCR检测Ndufs等基因的表达情况;通过流式细胞仪分析ROS的生成;提取不同脑区蛋白,测定GSH、SOD和MDA的含量;免疫组化观察DA、TH和VMAT的表达及定位;HPLC检测DA含量的变化。通过以上行为学指标、形态学分析、凋亡相关检测、线粒体功能测定、ROS水平检测以及神经递质合成和转运的研究,分析PQQ在PD模型大鼠体内的保护作用及相关机制。 【结果】 术后8周腹腔内注射APO可诱发PD模型大鼠以健侧后肢为支点向健侧旋转,PQQ给药能显著减少旋转次数,并减少中脑黑质多巴胺能神经元的丢失,抑制细胞凋亡的发生。PQQ能提高线粒体呼吸链复合物的活性和Ndufs的表达,增加抗氧化能力,促进TH和VMAT的表达,抑制DA在细胞内的重新分布。 【结论】 PQQ对鱼藤酮诱导的大鼠PD模型具有保护作用,作用可能与其保护线粒体功能、对抗氧化应激和促进DA的转运相关。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,董星月²,季锦燕³;指导教师:齐亚灵, 陈立强, 吴佳梅]]> 154true 【目的】 探讨不同剂量枸杞叶和枸杞多糖对5、7个月龄快速老化模型小鼠SAMP8脑海马星形胶质细胞及原代培养的SD大鼠脑海马星形胶质细胞α7nAChR表达的影响。 【方法】 实验一:选用 5、7 个月龄SAMP8,以同龄正常老化SAMR1 为正常对照。SAMP8随机分为给药组和对照组,给药组分为枸杞叶全汁高、低剂量组和枸杞多糖高、低剂量组。给药组灌胃服用高、低剂量枸杞叶全汁或枸杞多糖,每天1次,连续8周,对照组灌胃服用等量蒸馏水;免疫荧光双标染色检测SAMP8脑海马星形胶质细胞α7nAChR的表达。实验二:用含10%、20%枸杞叶及枸杞多糖脑脊液培养海马原代星形胶质细胞,于给药后培养24、36、48、72 h后收集细胞,采用MTS细胞活性检测,免疫荧光及蛋白质印迹法检测α7nAChR的表达。 【结果】 实验一:免疫荧光双标结果显示:(1)5、7 个月龄SAMR1较同月龄SAMP8脑海马区星形胶质细胞和α7nAChR阳性细胞表达均减少;(2)5个月龄SAMP8对照组较7个月龄SAMP8对照组脑海马区星形胶质细胞和α7nAChR阳性细胞表达均减少;(3)5、7个月龄SAMP8各给药组与同月龄SAMP8对照组比较,各给药组脑海马区星形胶质细胞和α7nAChR阳性细胞表达均减少;(4)同月龄高、低剂量组间无明显变化。实验二:(1)细胞活性结果显示:与空白脑脊液组比较,含10%、20%枸杞叶及枸杞多糖脑脊液培养海马原代星形胶质细胞36、48、72 h后,其细胞的活性均增加,但10%枸杞多糖脑脊液组有显著性差异;(2)蛋白质印迹结果显示:与空白脑脊液组比较,含10%、20%枸杞叶及枸杞多糖脑脊液培养海马原代星形胶质细胞36、48 h后,α7nAChR表达均增加,但10%枸杞多糖脑脊液组有显著性差异。 【结论】 不同剂量枸杞叶和枸杞多糖对5、7个月龄快速老化模型小鼠SAMP8及原代培养的SD大鼠脑海马星形胶质细胞α7nAChR表达均有影响。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,吴玉莹²,付松³,李伟³,张博圣³;指导教师:苗珍花, 王银]]> 153true 【目的】 帕金森病(PD)是常见的神经退行性疾病之一,遗传和环境因素均可导致PD的发生,但90%的PD为散发性。由于病因不明,临床上的治疗多为对症治疗,且药物治疗的副作用大,因此,寻找新的预防和治疗PD的生物活性物质具有重要的临床意义。Ghrelin是1999年发现的由28个氨基酸残基组成的脑肠肽,对其研究集中在摄食和能量代谢的调控上,近年来发现Ghrelin对下丘脑神经元具有保护作用,为了探讨Ghrelin对多巴胺(DA)能神经元的作用,本实验拟在环境毒素鱼藤酮制备的PD细胞模型上,观察其对DA能细胞损伤的保护作用,并深入探讨其机制。 【方法】 本实验选用的DA能细胞是MES23.5细胞,具有DA能神经元的主要特点。实验分为三组:对照组,鱼藤酮处理组(500 nmol/L鱼藤酮孵育24 h),Ghrelin+鱼藤酮处理组(10^-9 mol/L的Ghrelin预孵育20 min后,加入500 nmol/L鱼藤酮共同孵育24 h)。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位差和caspase-3活性,酶活性检测技术测定线粒体呼吸链复合物I的活性,蛋白质印迹法检测线粒体细胞色素C的释放,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学变化。 【结果】 鱼藤酮处理24 h后,细胞存活率降低39%(P<0.01)。而Ghrelin预孵育20 min,能显著拮抗鱼藤酮所致的细胞存活率的降低(P<0.01)。Ghrelin能够拮抗鱼藤酮导致的线粒体呼吸链复合物I活性的降低和跨膜电位差的降低,并进一步抑制鱼藤酮诱发的细胞色素 C由线粒体的释放。我们还观察了凋亡效应酶caspase-3活性的变化,在鱼藤酮处理组,细胞caspase-3的活性较对照组显著增加(P<0.01),而Ghrelin预孵育后,细胞caspase-3的活性较鱼藤酮组明显降低(P<0.05)。鱼藤酮孵育后,细胞出现明显的核碎裂与核固缩现象,而Ghrelin预处理后上述现象明显减轻。 【结论】 环境毒素鱼藤酮能够通过抑制DA能细胞线粒体呼吸链复合物I的活性,从而导致其功能的损伤,引起线粒体跨膜电位差的降低和细胞色素C的释放,并进一步诱发细胞的凋亡,而Ghrelin能够通过作用于线粒体呼吸链复合物I,从而恢复线粒体功能,抑制细胞凋亡,发挥其保护作用,但其细胞内的信号转导过程尚需进一步探讨。]]> 2014/12/11 10:03:22 152true 【目的】 探讨PI3K/Akt信号通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中对Wnt/β-catenin信号通路的影响。 【方法】 健康雄性SD大鼠96只,采用longa法建立局灶性脑缺血再灌注模型,随机分为4组:假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I组)、脑缺血再灌注+bFGF后处理组(bFGF组)、脑缺血再灌注+bFGF后处理+LY294002(LY组),各组24只大鼠。各组依据缺血后再灌注时间点12、24、48、72 h再分4个亚组。应用H-E染色、TUNEL法检测皮质组织形态变化及细胞凋亡情况。采用免疫组织化学法、原位杂交法、蛋白质印迹法分别检测在各组皮质不同再灌注时间点P-Akt、GSK-3β mRNA、β-catenin的表达变化。 【结果】 免疫组织化学法检测P-Akt蛋白水平, I组和LY组每一灌注时间点都高于S组表达水平,24 h达高峰。bFGF组各亚组皮质P-Akt表达均较I组和LY组各亚组表达增多(P<0.05)。应用原位杂交和蛋白质印迹技术分别检测GSK-3β mRNA和β-catenin在缺血再灌注皮质的表达。I组和LY组各亚组缺血皮质GSK-3β mRNA和β-catenin表达高于S组,分别在48 h和72 h达高峰。与I组和LY组比较,bFGF组各亚组缺血皮质GSK-3β mRNA表达明显降低,而β-catenin蛋白表达却显著增高(P<0.05)。说明bFGF在缺血再灌注皮质通过激活Akt,抑制GSK-3β的活性,拮抗由GSK-3β、axin和结肠多发性息肉样蛋白(APC)组成的复合物,使β-catenin不能被磷酸化,游离的β-catenin在细胞浆内蓄积,继而进入胞核,促进Wnt靶基因转录,抑制细胞凋亡。从两条通路主要成员激活的时间上,Akt在皮质缺血再灌注后24 h达高峰,而β-catenin是缺血再灌注后持续增高,一直到72 h达高峰。提示β-catenin参与了脑缺血再灌注PI3K/Akt激活后的信号传导路径,Akt对β-catenin的调控作用同样在缺血性脑损伤中发挥作用,即Akt-GSK-3β-β-catenin。 【结论】 脑缺血再灌注损伤中PI3K/Akt信号通路通过GSK-3β可以调控Wnt信号通路主要成员β-catenin,这为深入研究β-catenin在缺血性脑损伤中的作用机制提供重要线索。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,唐佳文²;指导教师:邢雪松]]> 151true 【目的】 探究不同依赖时间对甲基苯丙胺依赖者和海洛因依赖者空间认知功能的影响。 【方法】 甲基苯丙胺依赖者(40例,M1:甲基苯丙胺依赖1年组16例;M2:2年组24例)、海洛因依赖者(35例,H1:海洛因依赖3年组16例;H2:6年组17例)及对照者(40例)参与2个空间认知实验。实验1:判断6个不同角度手/足图片的手指/足趾朝向,评估被试者空间定向能力。实验2:判断6个不同旋转角度手/足图片肢体的左右,评估空间视觉化能力。 【结果】 (1)M1、M2组,H1、H2组与对照组相比,手足图片各个角度正确率无明显差异。(2)M1组对各个角度足图片的反应明显慢于M2、对照组。M1组对150°、180°和210°手图片的反应明显慢于对照组,210°上慢于M2组。H2组对240°、270°和300°足图片的反应慢于H1、对照组,H2组对各个角度手图片的反应较H1、对照组慢。(3)M2组各个角度足图片正确率明显低于对照组。M1、M2组各角度手图片正确率降低。H1组在120°、180°上,H2组在各个角度上,足图片的正确率显著低于对照组,且0°、240°和300°上, H1与H2两组之间存在差异。H1组在0°、180°、240°和300°上,H2组在各个角度上,手图片的正确率显著低于对照组;在60°、180°、300°上, H1与H2两组之间存在差异。(4)M2组对0°、60°、120°和180°足图片的反应,及对各角度手图片的反应快于M1、对照组。H2组对各个角度足图片的反应慢于H1组,仅在0°上慢于对照组。H2组对各个角度手图片的反应慢于H1、对照组。 【结论】 甲基苯丙胺与海洛因依赖不影响依赖者空间方位认知的准确性,但影响其认知速度。甲基苯丙胺和海洛因依赖损伤依赖者空间视觉化能力的准确性与认知速度,且长时间依赖者更为突出。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,2,边经纬^1,2;指导教师:罗艳琳]]> 150true 【目的】 为探究神经保护短肽NAP对社会隔离(social isolation,SI)模型小鼠抑郁样行为的影响及其机制。 【方法】 通过随机分组建立SI模型,以群养组(group housed, GH)为对照,利用构建好的带有NT4-NAP融合基因的腺相关病毒(AAV)经鼻给药进行干预,分为SI(NAP)、SI(AAV)、GH(NAP)、GH(AAV)四组,每组8只小鼠。首先,测试每组抑郁样行为,包括旷场实验(open field test, OFT)、强迫游泳(forced swimming test, FST)和悬尾实验(tail suspension test, TST)。同时检测模型建立后体重变化。其次,为探究NAP干预SI小鼠模型抑郁样行为的作用机理,根据目前已有抑郁症发病假说,利用ELISA技术选择检测小鼠脑内前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)、伏隔核(nucleus accumbens,NAc)、尾状核(caudate nucleus,CPu)和海马(hippocampus,HIP)等核团脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、五羟色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)和血清皮质酮(corticosterone)浓度变化。 【结果】 (1)NAP干预对体重的影响:从建立模型开始连续检测体重6周,发现SI组小鼠体重增长明显高于GH组;(2)NAP干预对行为的影响:OFT中,SI(AAV)组自主活动明显低于GH(AAV)组,但给予NAP干预后,SI(NAP)组与GH(NAP)组自主活动差异消失;FST中, SI(AAV)组不动时间明显高于GH(AAV)组,给予NAP干预后SI(NAP)组小鼠不动时间显著减短,与GH(NAP)组相比无统计学差异;TST中SI(AAV)组与GH(AAV)组无统计学差异,予NAP干预后有产生差异趋势;(3) NAP作用机理研究:测试脑内BDNF浓度发现,NAP干预后可逆转或减弱SI模型导致的PFC、NAc、CPu、HIP等核团中BDNF浓度差异;SI模型下,各核团SI(AAV)组与GH(AAV)组无统计学差异,予NAP干预后,SI组CPu、HIP核团中5-HT较GH组升高;SI(AAV)组血中皮质酮浓度明显低于GH(AAV)组,但予NAP干预后,SI(NAP)组与GH(NAP)组自主活动差异消失。 【结论】 NAP主要通过影响脑内BDNF和血中皮质酮浓度对抗小鼠社会隔离模型所致抑郁样改变。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,李白嘉²,毕航³,张磊¹;指导教师:党永辉]]> 149true 【目的】 脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)是指因脑缺血致脑组织坏死前,闭塞的脑血管再通后脑损伤进一步加重的现象,是引起多种脑部疾病的重要病理生理基础。小胶质细胞被证实是中枢神经系统的免疫细胞,有吞噬、抗原提呈和表达大量免疫相关因子的功能,脑缺血时小胶质细胞过度活化,释放大量自由基、炎症因子和前炎症物质,对中枢神经系统造成过多的病理损害,促使神经细胞的死亡,加重缺血性中风的损伤。Z-十八碳-9-烯-丙磺酰胺(N15)是油酰乙醇胺(oleoylethanolamide, OEA)的类似物,前期我们已经建立了稳定的小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,同时发现N15治疗后可以明显降低小鼠脑缺血后的神经功能损伤、减小脑梗死体积、减轻脑水肿和血脑屏障的通透性,降低脑缺血后损伤侧皮层炎症因子TNF-α、IL-6蛋白的表达。前期研究中已证明N15确切的脑缺血保护作用,但相关机制尚不清楚。在此课题中,我们利用线栓法建立小鼠局灶性脑缺血(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,研究N15对脑缺血再灌注小鼠的保护作用。 【方法】 利用免疫组化和蛋白质印迹法观察N15对脑缺血后小胶质细胞活化及分泌的前炎症细胞因子和细胞毒性介质的作用,并考察MAPKs(ERK、JNK和p38)、NF-κB、Nrf2、HO-1、NQO1等信号转导通路在N15调节小胶质细胞活化过程中的调控作用。以小胶质细胞活化及其释放的因子诱导的炎症反应为靶点,探索N15抗脑缺血新的作用机制。我们的研究将为N15开发成为新一代抗脑缺血药物奠定理论基础。]]> 2014/12/11 10:03:22 148true 【目的】 心肌梗死(MI)是导致心力衰竭(心衰)的最常见原因,以慢性炎症反应为特点的心脏重构是心衰发展过程中的重要环节。然而,导致MI后慢性炎症反应的具体机制尚不完全清楚。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种生物活性溶血鞘脂,本课题组前期发现S1P可减轻急性心肌缺血损伤。鞘氨醇激酶1(SphK1)和S1P裂解酶(SPL)分别是调控S1P生成和降解的关键酶,S1P受体1(S1PR1)是心肌表达的唯一S1P受体,本课题拟在前期证实MI后心肌组织中SphK1-S1P-S1PR1和SPL表达均显著升高的基础上,进一步研究S1P信号在MI后心衰中的作用。 【方法】 (1)80只雄性C57BL/6J小鼠(8~10周)随机分为以下4组:假手术组、MI组、MI+FTY720组、MI+THI组。FTY720可降低SphK1和S1PR1表达,于术后24 h腹腔注射给药,3 mg/(kg·d),1次/d,持续4周;THI是SPL抑制剂,于术后24 h 饮水饲喂,25 mg/L,2次/d,持续4周。以上各组分别于4周后行以下检测:①超声心动图,②心脏切片Masson-trichrome染色,③心肌组织S1P含量,④心肌组织SphK1、S1PR1、SPL、p-p65NF-κB/p65NF-κB、pSTAT3/STAT3的蛋白表达,⑤胎儿基因ANP、BNP和α-SMA的mRNA水平,⑥胶原蛋白Iα1、Iα2和IIIα1的mRNA水平。(2)分离培养SD乳鼠(1~2 d)心肌细胞,分别采用0、1.0 和10 mmol/L的S1P处理24 h,检测SPL、p-p65NF-κB/p65NF-κB的蛋白水平和TNF-α、IL-6、MCP-1和MMP2的mRNA水平。 【结果】 (1)与MI组相比,MI+FTY720组小鼠心肌组织中SphK1-S1P-S1PR1表达下降、NF-κB-STAT3活性下降、心脏重构显著减轻、心脏功能显著改善[左心室射血分数:MI+FTY720组(43.5±3.0)% vs MI组(32.4±2.7)%,P<0.05];与MI组相比,MI+THI组小鼠SphK1-S1P-S1PR1表达升高、NF-κB-STAT3活性增高、心脏重构显著加重、心脏功能显著下降[左心室射血分数:MI+THI组(25.4±2.3)% vs. MI组(32.4±2.7)%,P<0.05]。(2)在心肌细胞中,S1P处理24 h可剂量依赖性增加TNF-α、IL-6、MCP-1和MMP2的mRNA水平,并增加SPL的蛋白和mRNA水平。 【结论】 (1)MI后心肌组织中SphK1-S1P-S1PR1通过NF-κB-STAT3炎症信号促进心脏重构和心衰;(2)SPL在S1P的诱导下表达升高,通过降解S1P减轻MI后心脏重构和心衰。本研究首次揭示了病理性S1P信号参与MI心脏结构和功能的不良改变,为延缓缺血性心衰进展提供了新的潜在干预靶点。]]> 2014/12/11 10:03:22 147true 【目的】 研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用,并基于NO信号探索分析EOFAZ调控血管内皮功能的药效物质基础。 【方法】 体外传代培养HUVECs,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)考察LPS炎性损伤的量效-时效关系,建立LPS诱导的HUVECs炎性损伤模型。实验分为6组,即空白对照组、模型组、阿司匹林组(Asp,4 mmol/L)及EOFAZ高、中、低(4、1、0.25 μg/L )剂量组。阿司匹林及EOFAZ组于造模前干预保护1 h后,再加入LPS复制HUVECs炎性损伤模型。采用苏木精-伊红染色法(H-E)进行细胞形态学观察,MTT法分析细胞存活率,生化酶学法测定培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力,NO试剂盒测定上清液NO含量,研究EOFAZ对血管内皮功能的调控保护作用。依据EOFAZ气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术成分含量检测结果,并结合单成分分析法及正交试验方法测定EOFAZ主要物质成分对LPS诱导损伤的HUVECs的保护作用,并基于NO信号筛选其主要药效物质基础。 【结果】 H-E染色细胞核染为蓝色,胞浆染为淡红色。空白对照组细胞形态饱满,细胞核居中,细胞膜完整。与空白组比较,模型组细胞数目减少,间隙增大,胞核浓缩深染。经EOFAZ高、中、低剂量组及阿司匹林组干预保护后细胞形态可接近于正常。与空白组比较,LPS诱导损伤的HUVECs细胞存活率显著降低,LDH活力明显增加,内皮细胞NO分泌与释放减少。EOFAZ高、中、低剂量组及阿司匹林组干预保护后能显著改善和逆转上述改变。单成分分析法及正交设计试验结果显示,EOFAZ中含量较高的四种成分:α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉叶油醇、莰烯均能明显提高细胞存活率及提高培养上清液NO的分泌与释放,且呈一定剂量相关性。 【结论】 EOFAZ对LPS诱导的 HUVECs的损伤具有保护作用,其中α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉叶油醇、莰烯为EOFAZ调控血管内皮功能的主要药效物质基础。]]> 2014/12/11 10:03:22 146true 【目的】 通过建立动物肢体缺血模型,研究参黄液对肢体动脉缺血的治疗作用及机制。 【方法】 采用股动脉注射月桂酸的方法建立大鼠后肢缺血模型,将90只大鼠随机分为空白对照组、75%乙醇治疗组和参黄液治疗组,每组30只,分别于第7、14、21天观察大鼠后肢缺血程度,于第21天取后肢肌肉标本进行病理检查。 【结果】 与对照组和75%乙醇治疗组相比,参黄液治疗组的大鼠后肢缺血症状明显减轻,其肢端坏疽及感染范围明显减小,同时患肢跛行和肿胀减轻,且参黄液治疗组VEGF相关抗原的表达水平以及毛细血管密度均明显高于对照组和75%乙醇治疗组(P<0.05)。 【结论】 参黄液可以调节VEGF的表达,促进毛细血管生成,有效改善肢体动脉缺血,减轻坏疽肢端和感染。]]> 2014/12/11 10:03:22 1,孙岩²,何玉祥²,刘洋²,周华²,王茂华²,袁海²,金星²;指导教师:沈祥春, 张彦燕]]> 145true 【目的】 明确心肌缺血时P物质(substance P,SP)和强啡肽(dynorphin,DYN)在中枢神经系统的信号传导,阐明SP和DYN在脊髓电刺激(SCS)治疗心肌缺血的作用,以明确SCS治疗心肌缺血、缓解心绞痛的作用机制,为其临床应用推广奠定理论基础。 【方法】 将实验分为九组:正常对照组、心肌缺血组(CAO)、SCS组、CAO+SCS组、假手术+ibotenic acid组、SCS + ibotenic acid组、SCS + CAO + ibotenic acid组、SCS + nor-binaltorphimine 组、SCS + CAO + nor-binaltorphimine组,制作大鼠急性心肌缺血模型,心肌缺血前15 min在第一胸椎(T1)给予电刺激,连续刺激45 min,心肌缺血30 min,在术后3 h取材,一部分动物新鲜取材[第四胸椎(T4)和脑干],置-80℃冷冻保存,进行RT-PCR和蛋白质印迹检测,一部分大鼠经主动脉灌流固定,进行石蜡包埋用于免疫组化染色 。 【结果】 (1)心肌缺血致SP在脊髓胸段T4和脑干的表达增加;SCS可降低心肌缺血所致SP表达的增加。(2)SCS可使心肌缺血时DYN的表达增加。(3)在上颈髓给予选择性破坏神经细胞的ibotenic acid,抑制SP和DYN表达的改变。(4)在上颈髓给予阿片受体特异性阻滞剂nor-binaltorphimine,抑制SP和DYN表达的改变。 【结论】 SCS在上颈髓产生下行抑制,从而抑制脊髓胸段,使抑制性神经递质DYN表达增加,痛觉神经递质SP表达降低,而且DYN的增加来源于上颈髓神经元从而抑制SP的释放。]]> 2014/12/11 10:03:22 144true 【目的】 肠易激综合征(IBS)是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变为特征而无器质性病变的常见功能性肠病,在我国发病率约为10%,严重影响了患者的正常生活。已知P2X7受体参与多种炎症及神经损伤导致的慢性疾病,但在IBS发病过程中的作用尚不清楚。本实验重点研究P2X7受体在IBS模型大鼠中的表达及P2X7受体激动剂(Bz-ATP)与拮抗剂(BBG)对IBS的可能作用,探究P2X7受体与IBS之间的联系与机制,为IBS的临床治疗提供新的治疗靶点。 【方法】 采用两种IBS动物模型:(1)成年SD大鼠结直肠内注射30%的三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇溶液(40 mg/kg)进行诱导;(2)对出生10 d的SD幼鼠进行0.5%乙酸溶液灌肠,培育8~10周。动物分组:(1)正常对照组,TNBS模型组,BBG +TNBS模型组;(2)正常对照组,乙酸模型组,BBG+乙酸模型组和Bz-ATP组。BBG + 模型组(包括TNBS模型和乙酸模型)即模型大鼠连续4 d注射P2X7受体拮抗剂BBG (200 nmol/L,0.5 mL);Bz-ATP组即正常大鼠腹腔注射P2X7受体激动剂Bz-ATP(1 mmol/L,0.4 mL)。采用腹壁撤退反射(AWR)和内脏运动反射(VMR)分别检测大鼠的肠道痛觉敏感性,应用蛋白质印迹法测定肠道组织与背根神经节(DRG)中P2X7受体的蛋白表达量。应用SPSS软件对实验数据进行统计处理。 【结果】 (1)与正常对照组相比,TNBS模型组VMR幅值显著增加(P<0.05), DRG中的P2X7受体蛋白表达量无变化,而肠道组织中的P2X7受体蛋白表达量显著增加(P<0.05);与TNBS模型组相比,给予P2X7受体拮抗剂BBG后VMR幅值显著降低(P<0.05)。(2)与正常对照组相比,乙酸模型组AWR显著增高(P<0.01),VMR在结直肠压力为20、40、60、80 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)时分别升高59%、60%、91%、99%(P<0.05);与乙酸模型组相比,给予P2X7受体拮抗剂BBG后,AWR降低52.78%(P<0.01), VMR在结直肠压力为20、40、60、80 mmHg时分别降低51%、46%、68%、66%(P<0.05);与正常对照组相比,Bz-ATP组AWR显著增高(P<0.05)。 【结论】 P2X7受体激动剂显著增加大鼠的肠道痛觉敏感性,而在IBS模型大鼠全身给予P2X7受体拮抗剂能够显著降低肠道痛觉敏感性,同时P2X7受体在IBS模型大鼠肠道组织中表达显著增加。这些结果表明,肠道P2X7受体在IBS肠道高敏感的发生和发展中起到重要作用,并提示在IBS的临床治疗中,应用P2X7受体拮抗剂可能将显著降低IBS的腹痛等不适症状,进而改善患者的生活质量,因此P2X7受体作为IBS临床治疗的潜在药物作用靶点,对其作用机制的研究具有重要的理论价值和临床指导意义。]]> 2014/12/11 10:03:22 143true 【目的】 研究外源性给予茶多酚(TP)和ATP对兔心肌缺血再灌注心肌损伤模型的保护作用,以及两者联合作用的保护程度比较。 【方法】 60只家兔随机均分成5组:假手术处理组、缺血再灌注对照处理组、ATP处理组、茶多酚处理组、茶多酚与ATP联合处理组。观察茶多酚和ATP及两者联合作用对缺血再灌注后血流动力学参数指标中左心室的收缩与舒张的最大速率(±dp/dt_max)、心率(HR)、左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室收缩期峰压(LVSP),血液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达的影响。 【结果】 茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组左心室的收缩与舒张的最大速率明显好于缺血再灌注对照处理组(P<0.05);茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组心率及其恢复率明显好于缺血再灌注对照处理组(P<0.05); 茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组丙二醛含量明显低于缺血再灌注对照处理组(P<0.05); 茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组超氧化物歧化酶含量明显高于缺血再灌注对照处理组(P<0.05); 茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组乳酸脱氢酶含量明显低于缺血再灌注对照处理组(P<0.05);茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组丙二醛生成抑制率明显低于缺血再灌注对照处理组(P<0.05);茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组心肌型肌酸激酶同工酶含量明显低于缺血再灌注对照处理组(P<0.05);茶多酚处理组、ATP处理组、茶多酚与ATP联合处理组基质金属蛋白酶-2表达明显低于缺血再灌注对照处理组(P<0.05)。 【结论】 ATP和茶多酚在心肌缺血再灌注损伤时对心肌均有保护作用,联合使用有一定的加强效果。]]> 2014/12/11 10:03:22 142true 【目的】 在前期体外实验基础上建立两种不同的高脂血症模型,观察血胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的升高与NALP3 炎症小体激活的相关性,研究高脂血症、动脉粥样硬化早期时段免疫炎症系统的作用。 【方法】 ①小鼠蛋黄乳液诱导高脂血症模型:30只ICR小鼠随机分为空白对照组、高脂血症模型组(75%蛋黄乳液,0.2 mL/10 g,腹腔注射)和辛伐他汀组(20 mg/kg灌胃),每组10只,造模后16 h采样。②Triton WR 1339 诱导大鼠/小鼠高脂血症模型:SD大鼠24只/ICR小鼠30只随机分为空白对照组、高脂血症模型组(Triton 400 mg/kg腹腔注射)和辛伐他汀组,大鼠每组8只,小鼠每组10只,造模后24 h采样。③高脂饲料诱导的大鼠慢性高脂血症/动脉粥样硬化早期模型:SD大鼠分组同上。ELISA法测血清TC和TG含量,并检测血清IL-1β水平,蛋白质印迹法检测肝脏IL-1β、活化型caspase-1表达,免疫共沉淀测定NALP3的组装。采用SPSS 16.0进行统计学处理,并做NALP3激活与血脂的相关性分析。 【结果】 (部分)蛋黄乳液、Triton WR 1339均能诱导大鼠和(或)小鼠血TC和 TG 升高,与空白组相比差异有显著性;辛伐他汀能降低血TC和 TG,与模型组相比差异有显著性(P<0.01)。伴随着血脂的升高,NALP3炎症小体激活产物的表达升高,表现为IL-1B的升高和caspase-1的活化。蛋黄乳液诱导模型小鼠IL-1β升高[(61.1±11.5 )pg/mL],与空白组[(6.8±3.1) pg/mL]相比差异有显著性;辛伐他汀组[(39.4±14.1) pg/mL] 与模型组相比差异有显著性;Triton诱导模型小鼠IL-1β升高[(79.9 ±21.4)pg/mL],与空白组[(6.6 ±2.0 )pg/mL]相比差异有显著性;辛伐他汀组[(38.7 ±8.2)pg/mL]与模型组相比差异有显著性;Triton诱导模型大鼠IL-1β升高[(74.7±17.0)pg/mL],与空白组[(6.3 ±2.1)pg/mL]相比差异有显著性;辛伐他汀组[(37.4±7.8)pg/mL]与模型组相比差异有显著性。各模型组活化型caspase-1表达也升高,而辛伐他汀给药组caspase-1表达受到抑制。 【结论】 蛋黄乳液与Triton 腹腔注射都可以引起小鼠、大鼠血清中TC、TG含量升高;随着血脂升高,血中IL-1β含量升高、肝脏caspase-1的表达升高;而降脂药物辛伐他汀在降低血脂的同时,血中IL-1β含量下降,肝脏caspase-1的蛋白表达受到抑制,表明NALP3炎症小体可能参与了高脂血症促进动脉粥样硬化发展过程。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,郑淑予²,薛梦雯²;指导教师:商战平]]> 141true 【目的】 研究睡眠剥夺对小鼠肝脏形态、功能的影响以及TNF-α表达变化的病理意义。 【方法】 C57小鼠分为对照组以及24、48、60 h完全睡眠剥夺组,采用H-E染色观察各组小鼠肝脏的组织学变化;血清学检测各组谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性改变作为肝损害的标志;免疫组化检测TNF-α的表达部位及变化情况。 【结果】 (1)组织学改变:与对照组相比,各睡眠剥夺组小鼠肝组织随着剥夺时间的延长出现不同程度的病理改变。24 h睡眠剥夺组可见肝小叶排列紊乱、肝细胞大小不等,形态各异;48 h睡眠剥夺组中部分肝细胞内出现细小空泡,可见细胞及细胞核肿胀或萎缩;60 h睡眠剥夺组部分肝细胞出现脂肪变性及坏死,周围有炎细胞浸润。(2)血清学指标的改变:与对照组相比,各睡眠剥夺组中AST和ALT 水平显著升高 (P<0.05),并呈现出随睡眠剥夺时间延长而快速升高的趋势;对照组、剥夺24 h组及剥夺48 h组雌雄小鼠之间的AST和ALT 水平无差异(P>0.05);剥夺60 h组雄性小鼠的AST和ALT 水平显著高于雌性小鼠(P<0.01)。LDH 在各睡眠剥夺组肝脏中的水平高于对照组,并具有显著性差异(P<0.01);LDH水平随着睡眠剥夺时间延长至48 h达到峰值后呈缓慢下降趋势,至睡眠剥夺60 h后仍明显高于对照组(P<0.01);对照组及睡眠剥夺24 h组的雌雄小鼠血浆中LDH水平无差异(P>0.05),睡眠剥夺48 h组及60 h组的雌雄小鼠之间血浆LDH水平差异明显(P<0.05)。(3)TNF-α的表达变化:TNF-α在睡眠剥夺24 h组、48 h组及正常组的肝脏组织中均呈阴性表达,而在睡眠剥夺60 h组的小鼠肝细胞胞浆中呈强阳性表达,与对照组比较有显著意义(P<0.05);其中,雄鼠肝细胞胞浆中TNF-α的免疫阳性反应程度显著高于雌鼠(P<0.05)。 【结论】 完全睡眠剥夺可对小鼠肝脏的组织结构和功能造成严重损伤,其中雄性受到的损伤更显著提示雌激素可能对这一损伤具有保护作用。睡眠剥夺在导致肝脏损伤的同时可通过活化TNF-α诱发炎症反应而进一步加重肝脏损伤。]]> 2014/12/11 10:03:23 140true 【目的】 目前,间充质干细胞(MSC)治疗糖尿病足溃疡效果不佳,具体原因可能是高糖环境导致MSC增殖分化能力降低,并且诱导MSC产生大量炎症因子,导致溃疡局部组织微环境过度炎症。促红细胞生成素(EPO)是一种新型抗炎因子,我们将两者复合,探究EPO刺激的MSC促进糖尿病足溃疡愈合的效果以及其机制。 【方法】 在体实验,制备雄性糖尿病C57小鼠,随后结扎其后肢动脉,建立糖尿病足溃疡模型,随后将EPO刺激的MSC种植在新型生物材料上,将生物材料敷盖在C57小鼠的糖尿病足溃疡伤口上,观察伤口愈合效果并于第0、3、7、10天切取伤口皮肤组织并制备组织切片,采用免疫组织化学法,分别使用CD31、CD68单克隆抗体检测溃疡组织中的内皮/单核细胞。离体实验,培养MSC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),通过MTT法检测细胞增殖,通过划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移能力,通过酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测EPO刺激MSC后上清液中血管内皮生长因子(VEGF)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。 【结果】 在体实验证明实验组(EPO-MSC)溃疡愈合情况明显优于对照组(MSC组),并且实验组伤口组织新生血管多于对照组,免疫组织化学法证实实验组MSC分化成内皮细胞的比例多于对照组。体外实验证明促EPO能促进高糖环境中MSC分泌VEGF,促进内皮细胞生长和迁移,使其更好更快地形成血管。同时,EPO也可以减轻高糖环境对MSC的损伤,促进MSC增殖和迁移并且抑制高糖诱导MSC分泌炎症介质TNF-α。 【结论】 EPO刺激的MSC能有效促进糖尿病足溃疡愈合,其机制在于通过改善MSC局部微环境和抗炎症损伤来诱导血管再生进而促进糖尿病足溃疡愈合。]]> 2014/12/11 10:03:23 139true 【目的】 胰岛素抵抗贯穿于2型糖尿病的全过程,是2型糖尿病的病理学基础。骨骼肌是机体最大的胰岛素靶器官,是转运葡萄糖的主要场所,胰岛素抵抗的发生与骨骼肌相关性引起我们的兴趣。本课题拟建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛素抵抗模型,用黄芩苷和运动训练进行干预,初步观察药物和运动干预对肥胖小鼠胰岛素抵抗的影响。 【方法】 将64只健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为8组,正常喂食:空白组、运动组、黄芩苷组、运动+黄芩苷组;高脂喂食:高脂空白组、高脂运动组、高脂黄芩苷组、高脂运动+黄芩苷组。用高脂饲料喂养高脂组小鼠14周,测定体重、空腹血糖和糖耐量、胰岛素耐量指标,建立高脂小鼠模型,同时以正常饲料喂养正常组小鼠14周作为对照。 随之,给予相应组别灌胃黄芩苷或者进行运动训练11周,分别测定各组小鼠体重、空腹血糖、餐后血糖和血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、肌酸激酶等含量。取骨骼肌制作切片,油红染色观察脂质沉积的情况。黄芩苷剂量为(每日200 mg/kg);运动组小鼠用YLS-10B轮转式疲劳仪进项训练,20转/min,50 min/d,5 d/周。 【结果】 与高脂空白组相比,高脂黄芩苷组小鼠的体重、空腹血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明显下降,血清高密度脂蛋白明显升高,脂质沉积减少;与高脂空白组相比,高脂运动组小鼠的血清甘油三酯和低密度脂蛋白均明显下降,体重、空腹血糖、总胆固醇都有下降趋势,脂质沉积减少。与高脂运动组相比,高脂运动+黄芩苷组小鼠的空腹血糖和总胆固醇明显下降,体重、甘油三酯、低密度脂蛋白有下降趋势,高密度脂蛋白有升高趋势,脂质沉积减少。 【结论】 黄芩苷和运动训练对高脂小鼠均具有降脂作用、对高脂小鼠的异常糖代谢均具有改善空腹血糖和餐后血糖的作用,可能与改善骨骼肌的胰岛素抵抗有关。]]> 2014/12/11 10:03:23 138true 【目的】 行为敏化是指药物经过多次给药后,该药物的某一特定行为药理学效应增强的药理学现象。吗啡诱导的行为敏化在小鼠中表现为自主活动的增加。本研究探讨胡椒碱对吗啡诱导行为敏化效应表达的影响及其作用机制,为指导临床戒毒治疗和精神活性类药物的联合使用的研究提供线索。 【方法】 对实验小鼠[C57小黑鼠, 雄性,体重(20±3)g]应用腹腔注射吗啡(20 mg/kg, day 1; 10 mg/kg, day 8)建立行为敏化模型,之后各组小鼠腹腔给予不同浓度胡椒碱(0、5、10、20、40、80 mg/kg)以探究不同浓度胡椒碱对单针吗啡诱导的小鼠行为敏化表达的影响。通过TRPV1受体拮抗剂capsazepine(0、1.25、2.50、5.00 mg/kg)探究胡椒碱影响单针吗啡诱导的小鼠行为敏化表达的机制。运用红外线自主活动测定仪测定小鼠自主活动,并比较各组数据,用SPSS统计软件进行统计分析。 【结果】 (1)所有实验浓度的胡椒碱都能够使小鼠的自主活动能力降低,且差异具有统计学意义。(P<0.05)。(2)胡椒碱组的小鼠自主活动量随剂量增大而呈现出减少的趋势,但是未见有明显的剂量-效应依赖关系,有待进一步研究细化胡椒碱的浓度来观察。(3)现有浓度的capsazepine 处理组数据和其对照组的差异均无统计学意义,但实验中观察到1.25 mg/kg组呈现出抑制胡椒碱作用的趋势,后续实验仍在进行中。 【结论】 (1)胡椒碱可以抑制吗啡诱导的小鼠行为敏化,表现为小鼠自主活动的降低。但胡椒碱对行为敏化的抑制作用随时间逐步减弱,其作用也未见明显剂量-效应依赖关系。(2)TRPV1受体拮抗剂capsazepine与胡椒碱的作用关系尚不明确,有待后续实验继续探讨。]]> 2014/12/11 10:03:23 137true 【目的】 研究艳山姜挥发油(essential oil from Alpinia Zerumbet,EOFAZ)对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)炎性损伤的保护作用。 【方法】 体外培养HUVECs,以LPS复制HUVECs炎性损伤模型。MTT法分析探讨LPS复制模型的浓度与时间。预先1 h给予艳山姜挥发油,采用吉姆萨染色(Giemsa staining)进行形态学观察,MTT分析细胞存活率,生化酶学法分析培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力和NO含量;酶联免疫法分析白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、内皮素1(ET-1)的释放。 【结果】 与空白组(control)比较,模型组(LPS,LPS 15 μg/mL作用12 h)致HUVECs损伤。与模型组比较,艳山姜挥发油高(HD,4 μg/L)、中剂量组(MD,1 μg/L)、低剂量组(LD,0.25 μg/L)均可升高NO含量,降低LDH外漏,减少IL-1、IL-6和ET-1释放。 【结论】 艳山姜挥发油对LPS诱导的HUVECs炎性损伤具有保护作用。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,杨光燕²,付凌云¹,刘小红¹,令狐克刚³,石廷雨³;指导教师:陈长瑞]]> 136true 【目的】 探究牛磺酸对青春前期大鼠睾丸扭转复位后缺血再灌注损伤的保护作用。 【方法】 将32 只4 周龄健康雄性SD 大鼠,随机分为假手术组、生理盐水组、单次给药组(300 mg/kg)、连续给药组(300 mg/kg),每组8只,建立左侧睾丸扭转复位动物模型(720°,2 h)。生理盐水组与给药组于复位前30 min 分别腹腔注射生理盐水与牛磺酸,连续给药组术后每天注射一次牛磺酸注射液,连注7 d。于术后6周处死所有实验动物,取两侧睾丸,剔净睾丸附着筋膜,冷生理盐水洗净血污后滤纸拭干、称重。采用化学比色法检测睾丸组织中总抗氧化能力(T-AOC)及一氧化氮合酶(NOS)活性,羟胺法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,TBA 法检测丙二醛(MDA)含量。 【结果】 (1)与假手术组比较,生理盐水组的睾丸系数有所减少,差异无显著性(P>0.05);与生理盐水组比较,单次给药组和连续给药组的睾丸系数均有所增加,差异无显著性(P>0.05);与同侧生理盐水组比较,单次给药组和连续给药组手术侧、对侧的睾丸系数均有所增加,差异无显著性(P>0.05)。与同组对侧比较,手术侧睾丸系数有所下降,差异无显著性(P>0.05)。(2)与假手术组比较,各组睾丸组织(除连续给药组SOD 活性) SOD、T-AOC、NOS 活性均下降,MDA 含量升高,其中生理盐水组各指标差异显著(P<0.05);与同侧生理盐水组比较,单次给药组手术侧和对侧SOD、T-AOC、NOS 活性均升高,MDA含量降低,其中手术侧MDA 含量差异显著(P<0.05);与同侧生理盐水组比较,连续给药组手术侧和对侧SOD、T-AOC、NOS 活性均升高,MDA 含量降低,差异显著(P<0.05)。与同组手术侧比较,两给药组SOD、T-AOC、NOS 活性、MDA 含量均升高,其中连续给药组SOD 活性、单次给药组T-AOC 活性差异显著(P<0.05)。 【结论】 牛磺酸可以通过有效清除氧自由基、保护氧化酶活性和抑制脂质过氧化,对青春前期大鼠睾丸缺血再灌注损伤有明显的保护作用,并对其对侧睾丸组织损伤亦有一定的保护作用,且连续给药明显优于单次给药。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,张莹斌¹,施一波¹,徐忠娇¹,葛蕾洺¹,寿梦娜¹,裘磊²;指导教师:张金萍]]> 135true 【目的】 在促进MSCs骨形成的众多调节因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎发育及骨骼形成中扮演重要的角色。目前发现的BMPs家族成员骨诱导活性中,具有成骨活性的有 BMP2、7、9 亚型。除了BMP通路外,wnt通路在骨形成中也起到了重要的作用。本实验旨在进行BMP-2/wnt-3a、BMP-7/wnt-3a、BMP-9/wnt-3a三种联合转染,观察感染后细胞各基因和蛋白的干扰效率及细胞体外成骨分化的影响,评价三种转染的成骨分化能力的强弱,并与单独转染效果进行比较。 【方法】 以cDNA文库为模版,应用PCR方法获得BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a基因的编码序列,经大肠杆菌转化后抽取质粒,构建基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体并且经测序进一步确定。然后用pLP/VSVG、pLP2、pLP1质粒与BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a后转染小鼠间充质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。茜素红染色检测钙结节,蛋白质印迹和real-time PCR检测成骨相关基因(Runx2)的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。最后用双基因联合转染(BMP-2/wnt-3a,BMP-7/wnt-3a,BMP-9/wnt-3a三组)MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果;应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中BGP和ALP的表达水平;应用real-time PCR检测Runx2 mRNA的表达水平;应用蛋白质印迹法检测蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。 【结果】 pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a表达质粒构建成功。重组慢病毒pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞;Runx2表达水平:BMP2>BMP9>BMP7;茜素红染色显示BMP-2钙结节数量最多。双基因联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功;蛋白质印迹与real-time PCR法显示三组联合转染Runx2表达水平比单独转染明显上升,且联合转染Runx2表达水平:BMP-2/wnt-3a>BMP-9/wnt-3a>BMP-7/wnt-3a; BGP表达与 ALP表达亦然。 【结论】 BMPs能促进间充质干细胞向成骨细胞分化, 其中BMP2成骨效果最好。而BMPs与wnt-3a的联合转染成骨效果高于单独转染,说明BMP通路与wnt通路有协同作用。其中BMP-2/wnt-3a双基因联合转染比另两种转染(BMP-7/wnt-3a和BMP-9/wnt-3a)成骨效能更高。这为组织工程骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,常宇晨²;指导教师:史念珂]]> 134true 【目的】 老年黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是视网膜黄斑区的退行性病变,是我国中老年人最常见的致盲眼病之一。作为眼底黄斑区重要组成色素之一,叶黄素可能具有预防AMD的功效。本实验拟在前期研究基础上,比较AMD患者及对照人群膳食摄入叶黄素和机体叶黄素水平及视功能的差异,分析叶黄素对视功能的影响,探讨机体叶黄素的水平与AMD罹患之间的关系。 【方法】 依照修订后的 Age-Related Eye Disease Study(AREDS)诊断标准,采用眼底彩色照像对 AMD 进行诊断和分级后,募集符合项目要求的 AMD 患者 68 例及非AMD 对照 68 例。调查受试对象一般个人情况(姓名、性别、年龄、职业、文化程度、用眼卫生、眼部症状、疾病史及家族史)和营养状况;采用食物频率调查表记录分析其膳食营养摄入情况。采用 ETDRS 视力表测量最佳矫正视力;采用共焦激光眼底扫描系统计算分析视网膜黄斑色素密度(macular pigment optical density,MPOD)值;采用对比敏感度检查仪测量对比敏感度;采用光学相干断层扫描技术(optical coherence tomography,OCT)对研究对象的眼底形态进行检查;通过视功能相关的生存质量量表-25(VFQ-25)调查研究对象的一般健康及视力情况、活动时困难程度及其他一些视力问题。采用SPSS软件进行数据分析。 【结果】 膳食叶黄素及维生素、锌、其它类胡萝卜素摄入量与 AMD 的罹患风险均未见显著性关联。与低 MPOD 水平的人群相比,高 MPOD 水平的人群罹患 AMD 风险 OR (95%CI)为 0.29(0.13~0.55);且罹患 AMD 的风险随 MPOD 水平的增加显著降低(P<0.01)。AMD 患者低中频对比敏感度显著下降,AMD 患者最佳矫正视力和主观视功能较非 AMD 对照组有下降趋势。MPOD 水平与机体视功能密切相关;随 MPOD 水平提高,最佳矫正视力和对比敏感度均呈上升趋势。 【结论】 通过进行该项病例对照研究,我们发现膳食叶黄素摄入量与早期 AMD 患病未见显著性关联,高 MPOD 水平可显著降低 AMD 罹患风险。膳食叶黄素摄入量与 MPOD 水平密切相关,但随疾病程度加重血清叶黄素浓度与 MPOD 水平相关程度有下降趋势。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,郭芳¹,苏伊丹²,连婧阁²,张青青³,徐婵³;指导教师:史念珂]]> 133true 【目的】 溃疡性结肠炎的发病机制尚未明确,已知肠道黏膜免疫系统异常应答所导致的炎症尤其是白介素17(IL-17)信号在其发病中起重要作用。本研究目的是探究神经前体细胞表达发育调控样蛋白4(neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4-like,NEDD4L)对IL-17信号通路的可能调控作用,验证NEDD4L在溃疡性结肠炎发病中的功能。 【方法】 在干扰NEDD4L的人宫颈癌细胞系HeLa以及NEDD4L缺失的小鼠MEF细胞中,用实时定量PCR和ELISA法检测IL-17诱导的IL-6、CXCL2和CCL20的产生;用NEDD4L敲除的小鼠构建葡聚糖硫酸钠(dextran sulfact sodium,DSS)诱导肠炎的动物模型,监测小鼠体重、粪便性状及便血,分别在第5、7、9天处死小鼠,测量结肠长度,检测结肠的病理变化;收集29例溃疡性结肠炎组织样本,用免疫组化检测NEDD4L在结肠组织中的表达。 【结果】 在HeLa细胞和MEF细胞中,NEDD4L的缺失上调了IL-17诱导的IL-6、CXCL2、CCL20的产生(P<0.05)。NEDD4L缺失的小鼠用DSS诱导肠炎后体重下降更为显著(P<0.001),病理评分也更高(P<0.05),组织切片观察可见炎症反应更为剧烈。溃疡性结肠炎患者结肠黏膜上皮细胞的NEDD4L表达下降(P<0.05)。 【结论】 NEDD4L可负向调控IL-17诱导的细胞因子和趋化因子的产生,NEDD4L的低表达可能促进溃疡性结肠炎的发生和发展。]]> 2014/12/11 10:03:23 132true 【目的】 本研究相关的SIRT1去乙酰化酶属于NAD+依赖的非经典型组蛋白去乙酰基酶,和酵母中Sir2高度同源,其在生物进化进程中的高度保守性提示它们参与基本的生物学过程。研究表明,人SIRT1可催化p53蛋白去乙酰化从而抑制由DNA损伤引发的细胞凋亡,同时还可下调FOXO蛋白的转录活性来减少FOXO蛋白依赖的细胞凋亡;酵母中Sir2已经证实可阐释热量限制与长寿的联系。SIRT1的重要性引起研究者持续关注,因此希望能有快速简便的方法预测其底物位点来简化实验流程,这就促使我们试图建立一个有效的分类器,对于任意给定的一段含赖氨酸残基的短肽序列,判断其是人SIRT1底物位点的可能。 【方法】 我们从以往文献中查找到96个实验证实的SIRT1底物位点,通过分析去乙酰化修饰位点附近氨基酸序列的特征来建立分类器,但发现位点序列不具有明显的共性,仅利用序列信息建立的分类器对测试位点判断准确率最高只有56.77%。可见,位点序列信息并不能充分反映去乙酰化状态,所以我们在Gene Ontology数据库收集了更多的生物学信息:Biological Process(有相似生物通路的蛋白质更可能有相同的转录后修饰)、Cellular Component(亚细胞定位)、Molecular Function以及蛋白质之间相互作用等特征信息,然后整合生物学共性和序列信息并将所有位点聚类成组,每次用一组来训练或测试分类器,如果待测位点的这些信息与分类器重合度高就有可能是SIRT1底物位点,最后判断准确率显著上升至79.03%。之前有实验利用SIRT1敲除模型做质谱分析,筛选出乙酰化水平增高的位点作为SIRT1候选底物位点,我们的分类器预测的结果与此实验结果重合度很高,证实我们的分类器确实有效。 【结果】 整合功能信息后单个分类器准确率达79.03%;99个分类器准确率为93.57%;预测结果和实验结果高度重合。 【结论】 经验证我们的分类器效果显著,对预测SIRT1底物位点有较高的实用价值。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,吴峥²;指导教师:李婷婷]]> 131true 【目的】 面临人口老化进程加快和人们寿命提高的趋势,老年人群的健康已经成为社会科学和医学科学高度关注的重大问题。免疫系统衰老是生物体衰老的关键环节,它将导致机体免疫、造血、修复功能障碍和肿瘤发生率提高。本研究阐释人参抗衰老成分Rg1对免疫系统衰老调控作用及其相关机理,为防治衰老相关疾病,促进祖国医学发展提供理论与实验依据。 【方法】 建立D-半乳糖致免疫功能衰退大鼠模型,通过体内注射人参皂苷Rg1干预衰老进程。检测以下指标:(1)外周血白细胞与淋巴细胞总数及CD4⁺/CD8⁺T细胞比例;(2)股骨骨髓有核细胞数、细胞增殖与形成CFU-GM能力;(3)脾脏、胸腺实质结构比例与衰老细胞比例,脾细胞、胸腺细胞增殖能力,分泌IL-2/6,TNF-α,GM-CSF水平和细胞产生活ROS、SOD、MDA、GSH、GSSH水平;(4)腹腔巨噬细胞吞噬功能与吞噬指数。 【结果】 连续注射D-半乳糖能成功建立免疫功能衰退大鼠模型。与衰老模型组大鼠比较,注射人参皂苷Rg1使衰老大鼠白细胞和淋巴细胞总数提高,CD4⁺/CD8⁺T细胞比例升高;股骨骨髓有核细胞数升高、细胞增殖与形成CFU-GM能力提升;脾脏与胸腺实质结构比例增加,衰老细胞比例减少;脾细胞和胸腺细胞增殖能力提高,分泌IL-2/6、TNF-α、GM-CSF水平提高,产生AGEs、ROS、MDA、GSH/GSSG水平下降,SOD活性明显回升;腹腔吞噬细胞吞噬中性红能力明显增强,吞噬指数增加。 【结论】 (1)D-半乳糖能成功建立免疫功能衰退大鼠模型;(2)人参皂苷Rg1是人参的抗衰老成分,能有效提高免疫系统功能,阻止致衰剂导致的免疫系统衰退,其机理与拮抗D-半乳糖对免疫系统的氧化损伤密切相关。]]> 2014/12/11 10:03:23 130true 【目的】 本研究采用双酚A(bisphenol A,BPA)暴露的人滋养细胞模型(绒毛外滋养层细胞系HTR-8和合体化滋养层细胞系Bewo),分析滋养细胞分化及功能相关的重要基因的甲基化修饰及相应基因表达的改变,探索BPA暴露对滋养细胞的影响,从而为BPA高暴露人群提供科学的优生和生殖健康指导。 【方法】 蛋白质印迹法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GCM-1、systin-1等蛋白的表达;免疫荧光检测蛋白表达与定位;甲基化测序(BGS)验证DNA甲基化差异基因;Transwell实验检测滋养细胞侵袭能力;RT-PCR检测滋养细胞功能相关基因mRNA水平。 【结果】 粘附相关标志蛋白E-cadehrin在人滋养细胞侵袭模型HTR-8滋养细胞系中弱表达,其编码基因CDH1基因启动子呈超甲基化状态。BPA暴露后,E-cadherin的表达随BPA浓度增加呈梯度上调, 侵袭能力标志蛋白N-cadherin的表达呈梯度下调。Transwell实验显示HTR-8细胞的侵袭能力随BPA浓度增加而逐渐减弱;重亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequence,BSP)结果显示,BPA暴露后人基因组长重复序列LINE-1甲基化程度明显减少,人基因组短重复序列ALU甲基化程度无明显变化。蛋白质印迹和免疫荧光结果显示, BPA暴露的人滋养细胞合体化模型Bewo细胞系中,合体化标志蛋白systin-1和GCM-1的表达随BPA浓度增加而逐渐减弱。 【结论】 BPA暴露可使人滋养细胞侵袭模型HTR-8细胞系中粘附、侵袭相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达分别上调和下调,合体化模型Bewo细胞系中功能相关蛋白表达降低,这表明随BPA浓度增加,HTR-8细胞侵袭能力逐渐减弱,Bewo细胞合体化能力也逐渐减弱;伴随人基因组长重复序列LINE-1甲基化程度明显降低。研究结果显示,BPA可能通过DNA甲基化途径影响人滋养层细胞侵袭和合体化功能。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,邱喻兰²,谭秋菊²,罗美¹,刘佳¹;指导教师:丁裕斌]]> 129true 【目的】 建立大孔吸附树脂法富集高纯度穿山龙总皂苷(TSDN)的制备工艺,并考察其抗2型糖尿病(T2DM)的生物学活性及分子机制。 【方法】 (1)采用D101树脂富集TSDN,UV测定粗提物中TSDN含量,HPLC进行主成分定量分析。(2)在TSDN抗T2DM研究中,采用高脂饮食合并STZ(30 mg/kg)诱导T2DM大鼠,选取空腹血糖高于16.7 mmol/L的大鼠随机分为模型组、给药组(200、100和50 mg/kg TSDN)和阳性对照组(10 mg/kg,格列本脲),同时设空白组和单纯给药组(TSDN 200 mg/kg),灌胃给药12周。测定大鼠体重、饮水(饮食)量和尿量来评价TSDN对T2DM大鼠能量代谢的影响;测定空腹血糖、血清胰岛素等评价对T2DM大鼠血糖的影响;测定血脂水平评价对T2DM大鼠血脂的影响;测定自由基水平来考察TSDN的抗氧化能力;测定骨密度、肌酐和尿素氮水平评价对T2DM引起骨和肾损伤的保护作用;同时进行组织病理学分析,并采用ELISA法、real-time PCR和蛋白质印迹法进行分子机制的研究。 【结果】 (1)在TSDN制备中,采用D101大孔树脂用4BV 30%乙醇除杂,12BV 70%乙醇洗脱,产物得率为3.71%,TSDN含量为(87.32±5.7)%,其中原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的含量分别为(12.3±3.4)%、(23.1±1.9)%和(41.2±2.5)%。(2)在TSDN抗T2DM实验中,与模型组相比,不同剂量TSDN均能显著降低T2DM大鼠血糖和血脂水平、饮食(饮水)量;增加大鼠体重、促进胰岛素分泌、改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量;组织病理学检查表明TSDN可以增加肝糖原储存,减轻肝损伤;同时,能显著清除过量的自由基,并对T2DM引起的骨和肾脏损伤也有一定的保护作用。进一步结果表明TSDN可降低GSK-3β酶活力,下调TNF-α、IL-6等表达,降低MAPKs 磷酸化水平,上调IRS-1、GLUT-4等表达,并升高GK酶活力。 【结论】 建立的TSDN制备工艺简单可行,产物纯度高。TSDN具有较好的抗T2DM作用,这种作用是通过调节糖异生和糖酵解关键酶的表达、改善脂质代谢、降低氧化应激水平来实现的,本实验为TSDN抗T2DM研究提供了实验依据,也为该天然产物的深入研究和开发奠定了基础。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,胡玉鹏¹,张一萌²;指导教师:彭金咏]]> 128true 【目的】 通过研究糖基因ST8SIA家族在人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株KCL22及其耐阿霉素细胞株KCL22/ADR、CML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中表达的差异,明确糖基因ST8SIA家族与人CML多药耐药的相关性,为白血病耐药提供新的治疗策略和靶点。 【方法】 采用质谱技术检测KCL22及KCL22/ADR细胞表面N-糖链的组成差异;采用real-time PCR和蛋白质印迹法检测ST8SIA家族在人CML及其耐药细胞株、CML患者(28例)及CML耐药患者(48例)BMMC中的表达;通过RNA干扰技术特异性下调差异表达的糖基因,检测干扰前后CML细胞在体内、体外对化疗药物的敏感性、PI3K/Akt信号通路的激活情况及P-gp、MRP1的表达情况;特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002 和Akt shRNA分别作用于KCL22/ADR细胞,检测抑制前后该细胞体内、体外对化疗药物的敏感性。 【结果】 KCL22和KCL22/ADR细胞膜表面N-糖链的组成、唾液酸具有显著差异;ST8SIA4和ST8SIA6在人CML及其耐药细胞株、CML患者BMMC中表达具有显著差异;特异性下调ST8SIA4或ST8SIA6的表达,改变KCL22/ADR和KCL22细胞体内、体外的药物敏感性、PI3K/Akt信号通路分子和P-gp、MRP1表达;KCL22/ADR细胞经LY294002和Akt shRNA分别作用后,PI3K/Akt主要信号通路分子表达水平降低,同时该细胞的药物敏感性也增强(P<0.05)。 【结论】 人CML细胞株及CML患者BMMC中ST8SIA家族的表达具有显著差异,这些特征性改变与CML多药耐药具有相关性;CML多药耐药性可能是通过ST8SIA4、ST8SIA6介导PI3K/Akt信号通路调控P-gp、MRP1的表达改变实现的。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,张轶男¹,潘璆¹,斯艳君¹,陈丽惠¹,季淑婷²;指导教师:贾莉]]> 127true 【目的】 通过系统性筛选阿尔兹海默病(AD)患者发生相关的血清外泌体相关microRNA及其靶基因的相关研究,提示AD新的发病机制,并为AD的早期诊断和病程预测提供新的候选指标。 【方法】 通过高通量测序芯片数据比对AD患者和正常人的脑脊液和血清中的miRNA表达谱,获取在AD患者的脑脊液和血清中共同下调的一组miRNA;同时通过生物信息学预测靶向AD的相关致病基因APP、PSEN1、PSEN2等的miRNA,取两组共有的miRNA let-7e、mir-101-3p、mir-107作为候选基因。通过荧光素酶报告基因实验验证这一组miRNA对靶基因的抑制作用,及在人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y中转入miRNA的抑制剂检测细胞凋亡以验证miRNA的功能。通过外泌体富集试剂盒富集AD患者、正常人血清、人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y培养基中的外泌体,通过real-time qPCR检测上述miRNAs表达量及其随年龄变化情况。最后利用不同年龄段小鼠动物模型,通过地高辛荧光标记探针进行海马区miRNAs的原位杂交分析和小鼠血清外泌体的miRNAs检测,验证外周血与脑组织miRNA随年龄改变的相关性。 【结果】 在正常人的血清外泌体中发现let-7e、mir-101-3p、mir-107成熟体均随年龄发生显著下调,而且在AD患者中这组miRNA的表达下调更为显著。不同年龄组正常小鼠脑组织和血清外泌体中miRNA的表达量同样随着年龄增加而逐步下调。随后发现在SHSY5Y细胞中过表达上述miRNAs可以导致APP、PSEN1、PSEN2表达发生显著下调,进一步的荧光素酶报告基因分析提示这一组miRNA可以直接靶向APP、PSEN1、PSEN2的3'UTR区域导致其翻译抑制。 【结论】 我们发现脑组织中的一组miRNA随着年龄的增加逐渐下调,从而解除对AD的相关致病基因的转录后抑制,这可能是AD发生的新的分子机制并与疾病进程相关。结果还提示神经元细胞可能通过外泌体释放这一组miRNA,并可以在患者血清中的外泌体中进行检测,因此有希望为AD患者早期诊断和病程预测提供新的无创性诊断标志物。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,徐辰²;指导教师:贾莉]]> 126true 【目的】 伤口愈合对损伤组织结构重塑和功能恢复至关重要,巨噬细胞在促进伤口愈合中起重要作用,其功能障碍导致伤口愈合延迟,给患者身心和经济造成沉重负担。但伤口愈合中巨噬细胞功能调控机制目前尚不明确,已知过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)可通过多种机制调控巨噬细胞功能,但在伤口愈合中巨噬细胞是否表达PPARγ、以及可能如何参与伤口愈合过程并不清楚,我们采用巨噬细胞特异PPARγ敲除小鼠进行了研究。 【方法】 Cre-LoxP重组酶系统构建巨噬细胞特异PPARγ缺陷小鼠,建立小鼠皮肤切创模型,组织学技术检测伤口愈合、炎症细胞浸润和分子表达定位, RT-PCR、蛋白质印迹和ELISA法比较相关分子表达高低,流式细胞术检测细胞凋亡和巨噬细胞对凋亡细胞吞噬。 【结果】 伤口愈合过程中巨噬细胞PPARγ表达上调,提示巨噬细胞PPARγ可能影响伤口愈合;巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口愈合延迟,肉芽组织生成、胶原沉积和新生血管减少,并且伤口TNF-α表达显著升高;抗TNF-α抗体(aTNF-α)局部治疗显著改善巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口愈合延迟,提示TNF-α升高是导致伤口延迟愈合重要原因;巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口中,巨噬细胞TNF-α表达显著升高,但体外实验表明PPARγ无直接抑制巨噬细胞分泌TNF-α功能;进一步体外实验表明巨噬细胞PPARγ缺陷导致其在吞噬凋亡细胞过程中TNF-α表达显著增加,并且对凋亡细胞吞噬能力显著下降,同时体内实验发现巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口中巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能降低,并且局部凋亡细胞聚集;进一步实验发现巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠腹腔和伤口巨噬细胞吞噬相关分子表达显著降低;而采用PPARγ激动剂可促进小鼠伤口愈合、降低伤口凋亡细胞聚集和局部TNF-α水平。 【结论】 巨噬细胞PPARγ可通过促进伤口凋亡细胞吞噬清除,降低局部TNF-α水平,而调控伤口愈合过程。PPARγ激动剂可显著促进伤口愈合,PPARγ可望成为促伤口愈合的重要靶点。]]> 2014/12/11 10:03:23 125true 【目的】 目前pMHC复合体(即MHC分子与抗原肽的复合体)常被用来检测特异性T细胞的数量,还是T细胞功能分析、抗原表位验证以及T细胞靶向治疗等诸多方面的有力工具。但是其制备技术复杂,复性、折叠和纯化等步骤受多种因素限制,产出效率较低。国内目前尚无生产厂家,一定程度上限制了我国基础与临床免疫学的更快发展。本实验旨在制备小鼠H-2K^b/OVA_257-264复合体,验证其正确构象和与特异性T细胞TCR有效结合的功能,为在小鼠模型中进行移植排斥和肿瘤的生物治疗研究提供靶向工具。 【方法】 利用IPTG诱导编码小鼠H-2K^b蛋白重链的重组质粒和OVA-β2m 融合蛋白的重组质粒在大肠杆菌BL21中表达;通过超声粉碎、洗涤、化学纯化等方法收集两种重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度和分子大小;再经稀释复性法在体外折叠并超滤浓缩;利用尺寸排阻层析法在FPLC系统中纯化收集H-2K^b/OVA复合体,经BCA法蛋白定量后分装保存;通过包被细胞大小的PLGA微球,用H-2K^b分子构象特异性单抗进行荧光染色,经流式分析验证该复合体的空间构象;利用OVA抗原特异性的OT-1细胞株和流式细胞术分析检测该自制分子与TCR的结合能力。 【结果】 两种重组质粒在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析分子量同预计大小相等;复性、折叠、FPLC系统纯化洗脱后得到3个峰,其中第一个洗脱峰经SDS-PAGE鉴定证实含有重链蛋白和轻链蛋白,为H-2K^b/OVA复合体峰;流式荧光染色分析显示:该复合体包被PLGA后能与构象特异性抗体呈有效结合,提示构象正确;用该分子制备的PE-标记的H-2K^b/OVA四聚体染色OT-1转基因鼠的脾细胞,经流式检测:OT-1细胞占脾细胞群的16.35%。 【结论】 利用大肠杆菌成功表达了小鼠H-2K^b分子的重组重链和轻链,并经体外折叠和纯化成功制备了构象正确、能与特异性TCR结合的H-2K^b/OVA复合体。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,顾冬梅²,许文锦²;指导教师:沈传来]]> 124true 【目的】 骨质疏松症已成为世界公共卫生问题,针对骨质疏松症的基础及临床研究是目前国际研究的热点。目前已有实验证明PLA/γ-Fe₂O₃复合膜对于细胞的分化具有促进作用,但是由于复合膜是自然晾干的,纳米磁性材料分布不均,对细胞的生长不利,为了将这种材料的性能优化,根据在磁场下,磁性纳米粒子分布更加均匀的特性,通过实验验证在磁场下制备的磁性纳米材料对于细胞分化的促进作用更加明显。 【方法】 因为PLA在复合膜中起到支架和黏附作用,所有本项目将首先在磁场条件下组装纳米材料膜(γ-Fe₂O₃膜),研究其对成骨细胞的影响。利用qPCR、ALP等检测方法对不同组细胞的分化情况进行对比,并分析各项检测结果得出结论。然后进一步在γ-Fe₂O₃膜的基础上用PLA粘附,并对其对于成骨细胞的生长分化的作用进行研究。 【结果】 ALP染色结果:在磁场下制备的纳米磁性材料上接种的细胞染色明显比自然晾干的磁性纳米材料上接种的细胞颜色深且分散;qPCR检测结果:Oc、BMP2、ALP三种成骨细胞标志性基因的qPCR结果显示,在磁场下制备的纳米磁性材料上接种的细胞几种标志性基因含量明显比自然晾干的磁性纳米材料上接种的细胞含量多,且随着磁场强度的增强,基因含量随之增多。 【结论】 自然干的纳米材料+玻片上接种的细胞分化情况明显不如在磁场下组装的纳米基底,而且在不同场强下组装的纳米基底中随着场强增大,细胞分化生长均越来越好。磁场下组装的纳米材料对于细胞分化的促进作用要优于自然晾干的复合膜,且随着场强的增大,促进作用愈加明显。]]> 2014/12/11 10:03:23 123true 【目的】 探讨NADPH氧化酶来源的活性氧在糖尿病发生发展中起到的作用。 【方法】 我们建立了长时程高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的大鼠模型来模拟人类2型糖尿病。在此模型基础上,运用常规的形态学和生物化学测定有关蛋白质的含量;运用免疫放射法测定胰岛素的含量。通过对糖代谢通路关键酶、血糖、胰岛素的测定来判定大鼠糖尿病的发生、发展。通过对大鼠体内ROS、MDA、TOAS的测定来判定大鼠体内氧化应激的状态。通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及糖原磷酸化酶的活性来反映大鼠糖代谢通路的变化。 【结果】 apocynin可以明显降低糖尿病大鼠的血糖升高水平,于此同时,在apocynin的干预下,糖尿病大鼠体内的氧化应激的水平比其它各组明显降低,其还可降低糖尿病大鼠肝脏糖原分解关键酶的活性、使其更接近于正常水平。 【结论】 NADPH氧化酶来源的活性氧可能通过糖原分解通路,对2型糖尿病的发生发展发挥作用。]]> 2014/12/11 10:03:23 1,焦宇琼¹,康祺²;指导教师:施冬云]]> 122true 【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。]]> 2014/12/11 10:03:23 121true 【目的】 研究九里香抑制软骨细胞凋亡的分子机制是否与EP/cAMP/PKA/β-catenin途径有关。 【方法】 分离培养大鼠膝骨关节原代软骨细胞,给予1 μmol/L PGE2诱导刺激,利用分离九里香(200、100、50 mg/kg)灌胃1个月的大鼠含药血清进行培养。利用流式细胞术、TUNNEL、DAPI染色法研究软骨细胞凋亡情况,利用RT-PCR研究EP2和EP4 的mRNA表达,利用蛋白质印迹法研究EP2、EP4、PKA、p-PKA、p-GSK-3β、β-catenin、caspase-3等蛋白表达,利用ELISA法研究cAMP的表达,利用TOPFLASH/FOPFLASH双荧光素酶报告基因方法研究β-catenin调节的TCF/LEF转录活性。 【结果】 利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测发现,剂量为100、200 mg/kg的九里香可显著抑制软骨细胞凋亡,其凋亡率分别为9.41%和7.11%,而模型组的凋亡率为25.37%。利用TUNNEL、DAPI染色法也发现九里香可显著抑制软骨细胞凋亡。九里香组软骨细胞的EP2和EP4 的mRNA表达均显示下调,其中200 mg/kg剂量组相对模型组分别为0.67和0.61。EP2、EP4、cAMP、PKA、p-PKA、β-catenin、caspase-3等蛋白表达均下调,而p-GSK-3β则表达上调。转染TOPFLASH/FOPFLASH报告质粒后,发现九里香可显著抑制TOPFLASH活性,呈剂量依赖性,而FOPFLASH的活性无明显变化。 【结论】 九里香可抑制PGE2诱导的软骨细胞凋亡,可能是通过抑制EP/cAMP/PKA/β-catenin途径。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,叶坤琪²,林姗姗¹,李燕红¹,宋元³,薛枫³;指导教师:吴龙火]]> 120true 【目的】 骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)的高度自我更新和多向分化潜能等特性为解决胰岛移植供体来源提供了可能性。我们观察了乳鼠BMSC在不同浓度血清条件培养基中的诱导分化影响,检测了胰岛相关因子胰岛素(Insulin)、胰十二指肠同源性盒因子-l (pancreatic and duodenal homeobox factor-1,PDX-l)和巢素蛋白(Nestin)等基因的表达变化。 【方法】 从乳鼠股骨冲洗骨髓建立BMSC分离、培养方法,通过MTT方法检测BMSC增殖趋势,通过RT-PCR检测Insulin、PDX-1和Nestin mRNA表达变化,并用免疫荧光检测Insulin、PDX-1和Nestin蛋白在细胞内表达情况。 【结果】 高浓度血清条件培养基能诱导BMSC增殖与分化。与对照组相比较,诱导后BMSC表达的Insulin、和PDX-1 mRNA随血清浓度升高变化而显著性上调(P<0.05);Nestin mRNA随血清浓度升高变化而显著性下调(P<0.05)。免疫荧光检测显示,与1周刺激诱导时间相比较,BMSC表达Insulin和PDX-1蛋白在2周时表达显著性增强;Nestin蛋白在2周时显著性下降。 【结论】 高浓度血清条件培养基能促进大鼠BMSC表达胰岛相关基因Insulin、PDX-1和Nestin,并随着刺激诱导时间延长而发生不同的调节变化,提示BMSC能在不同微环境条件刺激下向胰岛样细胞(胰岛β样细胞)分化,为糖尿病治疗采用干细胞途径提供资料。]]> 2014/12/11 10:03:24 119true 【目的】 探讨寿胎丸对反复自然流产小鼠母胎界面SOCS1和SOCS3蛋白表达的影响,研究其治疗反复自然流产的分子生物学机制。 【方法】 设立正常妊娠组与自然流产模型组,并将自然流产模型小鼠随机分为4组,分别为模型组、寿胎丸低剂量组、寿胎丸中剂量组、寿胎丸高剂量组。应用免疫组化法和蛋白质印迹法分别检测孕14 d后各组蜕膜与胎盘组织SOCS1和SOCS3蛋白的表达。 【结果】 与模型组比较,寿胎丸低、中、高剂量组均可降低反复自然流产小鼠母胎界面SOCS1蛋白的表达,差异具有统计学意义(P<0.01),与正常妊娠组比较,差异无统计学意义(P>0.05);寿胎丸中、高剂量组可升高反复自然流产小鼠母胎界面SOCS3蛋白的表达,差异具有统计学意义(P<0.01),高剂量组与正常妊娠组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 【结论】 寿胎丸可能通过降低小鼠母胎界面SOCS1蛋白表达及提高SOCS3蛋白表达,进而调控Th1细胞向Th2方向分化,以达到治疗反复自然流产的目的。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,张卫¹,林政桦¹,陈佳芳²;指导教师:刘慧萍, 李玲]]> 118true 【目的】 LRRK2基因的多个单核苷酸多态性(SNP)位点与帕金森病(PD)密切相关,且具有明显的人种特异性,如G2019S只高发于白种人,亚洲人鲜见; 而G2385R仅发现于亚洲人种。本研究对特发于中国汉族人的R1628P在汉族人群中的特异性分布、不同亚群中的危险性及其在PD发病中的分子机理进行深入研究。 【方法】 统计学方法:文献筛选搜索全部R1628P和PD临床随机对照研究;应用Revman 5.0及Stata软件,对R1628P突变在汉族及非汉族人群中的分布情况及不同汉族人亚群的危险性进行荟萃分析。(1)生物信息学方法:应用PhosphoSNP 2.0、Scansite 3及GPS 2.1软件对R1628P位点进行分析,预测R1628P突变导致其相邻S1627位点成为与PD发病密切相关的CDK5磷酸化靶点的可能性。(2)细胞与分子生物学方法:野生型LRRK2和R1628P突变体,单独或与CDK5联合转染至细胞,免疫沉淀 LRRK2蛋白,观察LRRK2与CDK5结合能力,并应用体外激酶实验检测LRRK2激酶活性;再将其质粒转染至原代培养神经元中,应用单细胞计数检测H₂O₂处理后神经元死亡情况。 【结果】 通过荟萃分析,R1628P在汉族人群及非汉族人群中呈现典型的差异性分布,为中国汉族人群所特有,且R1628P在不同汉族人亚群中的致病危险度具有明显差别。(1)生物信息学方法提示R1628P突变导致其相邻S1627位点成为CDK5潜在的磷酸化靶点,是典型的磷酸化相关SNP的 Type II(+)位点。(2)细胞与分子生物学方法证实LRRK2的R1628P位点突变增强LRRK2与CDK5蛋白的结合能力;与野生型LRRK2相比,R1628P突变体的激酶活性无明显上调,但与CDK5共转可显著上调R1628P突变体的激酶活性,并且转染R1628P突变体的神经元对损伤更敏感;但CDK5敲除小鼠神经元中转染野生型及R1628P突变体的神经元无差别。 【结论】 本研究证实LRRK2基因的R1628P多态性在汉族人群及非汉族人群中呈现典型的差异性分布,为中国汉族人群所特有,并在不同汉族人亚群中的致病危险度具有明显差别;R1628P的致病分子机理为:R1628P突变导致其相邻S1627位点成为CDK5潜在的磷酸化靶点,在老年应激导致的CDK5活性上调时,R1628P突变提供CDK5“二次打击”的靶点,加速PD发病。本研究为探索PD发病分子机制提供新的研究线索,同时为治疗PD提供新的药物靶点。]]> 2014/12/11 10:03:24 117true 【目的】 亨廷顿病(HD)基因突变后编码的突变亨廷顿蛋白(mHtt)通过干扰神经元的细胞周期,造成神经元死亡;钙反应性反式激活子(CREST)可促进神经元分化发育。本项目研究mHtt是否通过影响CREST而产生细胞毒性。 【方法】 应用免疫印迹、RT-PCR检测HD转基因小鼠(R6/2小鼠)和转染表达mHtt的小鼠成神经瘤细胞(N2a细胞)中CREST的蛋白和mRNA水平,应用生物信息学方法和缺失突变实验分析检测CREST中可能酶解位点,应用台盼蓝和PI染色检测细胞活力,以无血清培养进行神经细胞分化诱导,以N2a细胞突起生长长度反映其分化能力。 【结果】 在HD转基因小鼠大脑皮质、纹状体、海马内及转染表达mHtt的N2a细胞内,CREST蛋白水平明显降低,但其mRNA水平无显著改变,提示mHtt不影响CREST的转录表达,但可引起CREST翻译后水平的改变。在全长CREST(55 kDa)蛋白水平降低的同时,一个分子量在35 kDa左右的CREST裂解片段水平显著增加。生物信息学分析发现,CREST分子中不存在半胱氨酸蛋白酶(caspase)酶切位点,但存在多个可能的钙蛋白酶(calpain)酶切位点。在表达mHtt的N2a细胞用calpain活性抑制剂calpeptin处理后,35 kDa-CREST片段的产生减少,而全长CREST水平的降低被抑制。分别用HA和Flag标签对全长CREST蛋白的氨基端和羧基端进行标记,构建了HA-CREST-flag质粒,与表达mHtt的质粒共转N2a细胞后,发现35 kDa-CREST片段可以被Flag抗体检测到,而不能被HA抗体检测到;缺失132-139aa的CREST在表达mHtt的细胞中产生与对照细胞水平相近的35 kDa羧基末端片段,而其他缺失钙蛋白酶可能裂解位点的CREST在表达mHtt的细胞中仍产生高水平的35 kDa羧基末端片段。因此,被mHtt激活的钙蛋白酶主要在CREST的132-139aa部位对其进行裂解。对细胞活力的分析发现,在转染表达mHtt的N2a细胞中,过表达CREST可以显著降低台盼蓝和PI染色阳性的死细胞比率;过表达CREST还可显著纠正mHtt对N2a细胞突起生长的抑制。细胞活力分析和突起生长检测结果提示,mHtt对细胞的毒性和对分化的抑制与其降低CREST蛋白水平有关。 【结论】 mHtt在CREST 132-139aa处通过钙蛋白酶相关的蛋白裂解方式促进CREST的降解,引起CREST促神经元分化功能的降低而产生细胞毒性。该研究进一步揭示了HD的病理学机制,并为探索治疗HD的方法提供了新的线索。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,漆艺玮²,丁胜男²,龙雪峰²;指导教师:李和, 彭挺]]> 116true 【目的】 骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于其来源方便、易于分离培养、具有多分化潜能、可自体移植等优点,在组织损伤修复领域受到了广泛关注。但早期大量的移植后细胞死亡是阻碍其发展的主要障碍之一。近年来研究表明局部微环境高浓度的ATP可能是导致细胞移植后死亡的因素之一。本课题将探究体外高浓度(>1 mmol/L)的ATP对大鼠BMSCs的死亡诱导作用及其是否与P2X7受体(P2X7R)和(或)Pannexin-1的激活有关,为减少BMSCs移植后死亡提供一条新的思路,以促进其在组织损伤修复中的应用。 【方法】 (1)细胞凋亡检测(CCK试剂盒; caspase-3蛋白检测;Annexin V/PI试剂盒);(2)染料摄取实验观察细胞膜孔隙形成以及激光共聚焦显微镜动态监测细胞内钙的变化;(3)细胞免疫荧光组织化学技术。 【结果】 (1)体外高浓度的ATP诱导大鼠BMSCs死亡;高浓度ATP (5、10 mmol/L) 处理大鼠BMSCs 24 h后细胞出现明显凋亡。蛋白质印迹结果显示10 mmol/L ATP 处理24、48 h后,细胞内caspase-3表达明显增加。(2)高浓度ATP诱导的大鼠BMSCs死亡的机制可能与细胞膜孔隙的形成和(或)细胞内钙超载有关;加入10 mmol/L ATP后,荧光显微镜观察显示细胞对 Ethidium Bromide染料的摄取明显增加,提示细胞膜上孔隙形成;通过激光共聚焦显微镜监测ATP干预后细胞内钙离子浓度的变化,结果显示ATP处理组细胞内Fluo-4荧光亮度随时间逐渐增强。这些数据提示高浓度ATP诱导的BMSCs死亡的机制可能与细胞膜孔隙的形成和(或)细胞内钙超载有关。(3)Pannexin-1半通道蛋白参与ATP诱导的BMSCs细胞毒性效应;细胞免疫荧光染色显示大鼠BMSCs有Pannexin-1表达。Pannexin-1的特异性阻断剂CBX可以部分阻断ATP诱导的BMSCs的死亡。(4)大鼠BMSCs表达P2X7R;细胞免疫荧光染色结果显示大鼠BMSCs表达P2X7R,但P2X7R的阻断剂oxATP不能逆转ATP诱导的细胞毒性作用。这可能是由于oxATP并不能特异性阻断P2X7R。下一步我们计划用特异性siRNA使大鼠BMSCs上P2X7R表达下调再进一步观察。 【结论】 高浓度的ATP诱导大鼠BMSCs死亡,其机制可能与细胞膜孔隙的形成和(或)细胞内钙超载有关;Pannexin-1参与了ATP诱导的大鼠BMSCs死亡作用。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,李国勇²,刘娜威²,谭巧云²,马小桐³;指导教师:罗娟]]> 115true 【目的】 多氯联苯(PCB)在工业上曾作为电介质、润滑剂、增塑剂被广泛应用,是种难分解的氯代芳烃族内分泌干扰物,由于过去大量使用且难分解并通过生物链累积,因此PCB在环境中仍然普遍存在,对动物和人体的生殖系统、免疫系统等造成巨大伤害。诱导氧化损伤是PCB生殖毒性机制中一个最重要的途径,那么具有抗氧化活性的物质就有可能预防PCB的毒性。乌贼墨是由软体动物乌贼墨囊中的分泌腺合成的,含有多种海洋活性物质。而乌贼墨多糖是从乌贼墨中分离提取得到的一种新型海洋活性物质,最近的研究结果表明,其具有较高的体外抗氧化活性。由于PCB能引起自由基的产生和氧化损伤,而乌贼墨多糖具有清除自由基的作用,加之目前关于乌贼墨多糖与PCB相互作用的机理还未有报道。为此,本研究以小鼠生殖细胞作为模型,探讨并阐明金乌贼墨多糖缓解PCB引起的生殖毒性作用,为动物食源性乌贼墨多糖用于防治氧化性PCB生殖毒性提供理论指导。 【方法】 采用木瓜蛋白酶水解和Sevag结合的方法提取和纯化金乌贼墨多糖,并采用高效液相色谱对其进行分析鉴定。建立小鼠生殖细胞-体细胞无血清共培养模型,确定PCB对生殖细胞的毒性作用依赖的剂量和作用时间。不同剂量水平的金乌贼墨多糖与PCB联合作用,分析金乌贼墨多糖对多氯联苯引起的生殖细胞损伤的缓解作用。 【结果】 高效液相色谱及光谱分析结果显示,经木瓜蛋白酶水解和Sevag结合的方法所制备的金乌贼墨多糖成分均一,分子量约为37 ku。10 μg／mL的PCB会导致小鼠生殖细胞核染色质固缩,细胞出现脱落和崩解,产生严重的细胞毒性。添加金乌贼墨多糖则可缓解PCB的细胞毒性,细胞活性得到恢复。 【结论】 实验表明,具有抗氧化活性的金乌贼墨多糖能够缓解PCB的氧化损伤,防止PCB的生殖毒性。]]> 2014/12/11 10:03:24 114true 【目的】 L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)是生物转化生产功能性糖L-阿拉伯糖的关键酶。尽管对L-AI的研究已达数十年,但直到2006年,首个来源于大肠杆菌(E. coli)的L-AI(ECAI)的晶体结构才被解析出来,但其最高分辨率仅为2.6,且只解析出了单酶的空间结构。到目前为止,虽然对L-AI的研究不断深入,但是未见有其晶体结构的相关报道。我们在研究过程中发现L-AI家族蛋白难以结晶,因此本文拟通过研究来源于一株嗜热菌的L-AI,研究导致其不能结晶的可能原因。 【方法】 通过分子克隆手段,实现嗜热菌L-AI编码基因在E.coli中的异源表达;通过镍柱亲和层析纯化得到L-AI纯酶;通过SDS-PAGE及蛋白质印迹检测,分析L-AI在溶液中的状态。 【结果】 SDS-PAGE结果显示,L-AI经过镍柱纯化后基本可达到电泳纯,即只有一条蛋白条带;蛋白质印迹结果显示,在目的蛋白条带上下方存在多条蛋白条带,上方条带可能是L-AI发生聚集所致,下方条带可能是L-AI被降解所致。 【结论】 实验表明,L-AI在溶液中不是以均一形态存在的,可能存在多种形态,而且L-AI易被降解。因此,影响L-AI结晶的可能原因包括蛋白聚集所导致的构象不均一以及目的蛋白被降解。]]> 2014/12/11 10:03:24 113true 【目的】 通过对原癌基因USP22的5'端启动子活性分析,获得 PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据并探索其中机制。 【方法】 克隆USP22基因5'端核心启动子,定向插入荧光素酶报告载体pGL3-Basic;重组质粒经脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞12 h后,分别采用PKA信号的激动剂Forkslin和抑制剂H-89刺激;双萤光素酶实验分析USP22启动子片段的相对活性;在此基础上,利用real-time PCR检测Forkslin和H-89对内源性USP22表达影响,以获得PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据;采用DNA定点突变技术,剔除该启动子区一个典型的CREB/ATF结合位点,经Forkslin和H-89处理,双萤光素酶检测以证实PKA信号通路通过CREB/ATF反应元件调控USP22的转录;最后,联合染色质免疫共沉淀(ChIP)与real-time PCR实验观察H-89对转录因子CREB与USP22启动子结合能力的影响。 【结果】 USP22基因的启动子活性及内源性mRNA表达受到PKA通路抑制剂H-89的显著抑制,但并未因为PKA的激活而出现明显上调;破坏CREB/ATF结合位点可消除USP22启动子对H-89的反应性;H-89抑制CREB与USP22启动子中CREB/ATF反应元件的结合导致USP22转录活性的下降。 【结论】 CREB/ATF结合位点控制着USP22基因的常规表达;USP22的转录受到PKA信号通路的正性调控;PKA信号通路通过转录因子CREB实现上述功能。]]> 2014/12/11 10:03:24 112true 【目的】 探究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、定向成骨分化的影响以及相关信号通路。 【方法】 采用差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞,取P3代细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线、流式细胞术测定细胞表面标志。实验采用不同浓度的复叶耳蕨总黄酮培养基对大鼠BMSCs定向诱导分化,观察BMSCs诱导分化过程中诱导细胞的形态;测定诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和组织化学染色观察钙化结节形成能力;采用RT-PCR和ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中的WNT和BMP通路转导体及其交汇靶点Runx2相关基因表达。 【结果】 体外培养的细胞表达BMSCs细胞表面标志;复叶耳蕨总黄酮对BMSCs增殖具有一定的抑制作用;促进BMSCs分化为成骨细胞;增强ALP活性和钙结节形成;上调WNT通路转导体β-catenin、cyclinD1和BMP通路转导体BMP2、BMP4、两条通路交互靶点Runx2以及骨桥蛋白、骨钙蛋白和Ⅰ型胶原基因表达。 【结论】 复叶耳蕨总黄酮能够上调BMP和WNT通路,促进网络靶点Runx2表达,从而促进大鼠BMSCs定向分化为成骨细胞。]]> 2014/12/11 10:03:24 111true 【目的】 筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子,证实该蛋白与Wee1B的相互作用及作用机制,并进一步探讨其对小鼠受精卵早期发育的影响,本研究对揭示小鼠受精卵早期发育的分子机制和生殖机理具有十分重要的意义,为优化人类辅助生殖提供理论和实验依据。 【方法】 构建pGBKT7-Wee1B诱饵质粒并转入酵母感受态细胞中检测其对酵母的毒性、自激活能力以及表达情况,再将含有pGBKT7-Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定。经酵母重新转化验证后,在哺乳动物细胞中使用免疫共沉淀和免疫荧光共定位的方法确定候选分子与Wee1B蛋白激酶的相互作用。过表达或降低筛选分子,并显微注射入小鼠1-细胞期受精卵中观察Wee1B的蛋白激酶活性和定位的变化及候选分子是否通过Wee1B调控小鼠受精卵的早期发育。 【结果】 以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT野生型质粒为模板,设计特异性引物构建出pGBKT7-Wee1B诱饵质粒;诱饵质粒pGBKT7-Wee1B对酵母感受态细胞无毒性,无自激活能力,通过蛋白质印迹法验证其在酵母感受态细胞中表达;酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出了9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白;免疫共沉淀证实蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在HEK293细胞中存在相互作用;免疫荧光共定位确定蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在小鼠受精卵中共定位;干预KHDRBS3影响Wee1B的蛋白激酶活性和定位,并影响小鼠受精卵的早期发育。 【结论】 成功构建pGBKT7-Wee1B质粒,并以此为诱饵,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库筛选出KHDRBS3蛋白;免疫共沉淀证实KHDRBS3与Wee1B存在相互作用,且二者在小鼠1-细胞期受精卵中共定位。以上提示KHDRBS3蛋白可能通过调控Wee1B的蛋白激酶活性和定位进而参与小鼠受精卵的早期发育。]]> 2014/12/11 10:03:24 110true 【目的】 获得四川泸州非小红细胞低色素贫血健康个体及G6PD缺乏症患者α-珠蛋白拷贝数缺失的频率,为该地区加强开展预防缺失型α-地贫的分子筛查和产前基因诊断提供理论依据。 【方法】 祖籍为四川泸州的200例无血缘关系的非小红细胞低色素贫血健康个体及经高铁血红蛋白还原法诊断为G6PD缺乏症的108例无血缘关系患者的外周血均来至于泸州医学院附属医院检验科,常规酚氯仿法行外周血基因组DNA的提取,定制合成引物,选取扩增效率较高的引物进行单管多重缺口PCR技术(gap-PCR)检测α-珠蛋白拷贝数缺失,调整4对引物的浓度及比例,优化反应体系,确定PCR扩增的最适反应条件。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离,溴乙啶染色,Gel Doc1000凝胶成像分析系统观察并保存电泳结果。有1.6 kb的扩增条带表明有-α3.7缺失;有1.5 kb的扩增条带表明有-α4.2缺失;有0.8 kb的扩增条带表明有--SEA缺失;有1.9 kb的扩增条带则表明α1和α2珠蛋白基因都没有缺失。 【结果】 200例健康人群检测出6例有α-珠蛋白基因拷贝数的缺失,占3%。其中有4例左侧缺失(-α4.2/αα),2例右侧缺失(-α3.7/αα)。 108例G6PD缺乏症患者中有7例有α-珠蛋白基因拷贝数的缺失,占6.48%,其中有2例左侧缺失(-α4.2/αα),2例右侧缺失型(-α3.7/αα),2例东南亚缺失(--SEA/αα),1例右侧缺失合并东南亚缺失(-α3.7/--SEA)。 G6PD缺乏症患者α-珠蛋白基因拷贝数缺失的频率显著高于健康人群。 【结论】 四川泸州健康人群α-珠蛋白基因拷贝数缺失的频率高于四川成都人群的1.92%,该地区育龄夫妇应加强开展α-珠蛋白基因拷贝数缺失的检测,尤其当夫妇一方为G6PD患者时尤为必要。]]> 2014/12/11 10:03:24 109true 【目的】 针对当今社会越来越严重的假肉事件,建立一种快速、特异性强的基因鉴定方法,实现对猪、牛、羊、马、鸡、犬、鼠等常见肉类和加工熟食肉制品的鉴定。 【方法】 利用DNA条形码原理,用Genedoc软件多序列比对猪、牛、羊、马、鸡、犬以及鼠等常见肉源动物线粒体基因,寻找能够特异性区分各物种和亚种的基因片段。针对DNA序列,利用Primer Premier 6.0设计特异性引物,考虑到加工的熟肉制品DNA存在降解,引物设计时PCR产物大小限定在350 bp以下。随机混合2~3种肉类DNA,采用多重PCR方法扩增,检测引物的特异性。利用PCR方法,稀释DNA模板以10、1、0.1、0.01 ng进行PCR扩增,检测PCR的灵敏度。在羊肉中按10%、5%、1%比例混入猪肉,取100 mg混合肉,提取DNA并用猪肉引物进行PCR扩增,评价样品检测的灵敏度。以熟肉包、泡椒凤爪、香肠、牛肉粒、鸡肉派等深加工肉为原料,检测上述PCR方法的适用性。 【结果】 通过序列比对,选择线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)作为受检基因, COⅠ基因1 680~1 710 bp区域有极高的物种特异性,例如水牛和奶牛、山羊和绵羊在该DNA区域的差异碱基有5~7个。以该区域为PCR下游引物,分别针对每个物种设定上游引物,建立了七种动物源性成分的DNA条形码。DNA条形码区域为COⅠ基因1 200~1 710bp的序列,其中猪、水牛、山羊、马、鸡、犬、鼠7种动物的PCR产物大小分别为103、313、157、120、251、119和128 bp。对于大小接近的PCR产物,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测。结果表明利用COⅠ基因,通过混合模板、混合引物进行交叉PCR,均能特异性检测相应肉类。DNA模板的灵敏度可达0.01 ng,肉制品中1%的假肉(猪肉,1 mg)可被检出,熟肉的基因鉴定也是阳性。 【结论】 利用COⅠ基因1 200~1 710 bp区域,可以较好的区分不同肉类物种。该PCR方法特异性强、灵敏度高,所需检材微量,方法不受添加剂和高温加工等干扰,快捷准确,可作为肉制品中动物源性成分的鉴定方法进行推广。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,戴振宇²,杨斯苒²,胡申²,谢燊²;指导教师:黄春洪, 朱伟锋]]> 108true 【目的】 在前期证实粘蛋白1(MUC1)通过封闭TLRs信号通路抑制呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的呼吸道炎症的基础上,以TLRs细胞内段TIR结构域相互作用的结构特点为基础,通过生物信息学分析确定MUC1胞内段(MUC1 CT)抗炎多肽的候选区域,并构建各种候选区域的缺失突变体真核、原核表达载体,进而找出发挥抗炎作用的多肽片段,并在体外验证其抗炎效果。 【方法】 根据生物信息学技术预测分析MUC1 CT潜在的抗炎片段;构建MUC1 CT各种缺失突变体的真、原核表达载体,即pEGFP-C2-MUC1 CT mutants、pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants以及pET14b-MCS-SBP-EGFP-MUC1 CT mutants-TAT;转染pEGFP-C2-MUC1 CT mutants入A549细胞(来源于II型肺泡上皮细胞),利用荧光显微技术明确各绿色荧光蛋白标记的突变体蛋白的细胞内定位;转染pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants(无异常定位的突变体)入A549细胞,待MUC1 CT mutants高表达后,用RSV感染各组细胞一定时间后,使用ELISA方法测定细胞培养上清中TNF-α的水平,筛选发挥抗炎作用的多肽片段;在明确MUC1 CT的核心抗炎片段的基础上,转化pET14b-SBP-EGFP-MUC1 CT mutant入大肠杆菌(DE₃),体外表达并纯化含有穿透肽(TAT)的MUC1 CT突变多肽,预先与A549细胞孵育,再给予RSV感染,通过测定上清中的TNF-α的水平,进一步明确具有抗炎活性的片段。 【结果】 (1)通过生物信息学分析MUC1 CT,确定四处具有潜在抗炎活性的候选区域,分别是氨基酸位点7-14位,19-26位,36-40位,44-53位;(2)成功构建基于pEGFP-C2和pcDNA3-HA真核表达载体的四种缺失突变体的真核表达载体;(3)通过pEGFP-C2-MUC1 CT mutants明确各种突变体的细胞内定位情况;(4)利用pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants明确MUC1 CT的抗炎片段;(5)通过带有TAT的MUC1 CT突变多肽进一步证实该段的抗炎活性。 【结论】 MUC1 CT抗炎片段在体外实验中具有抗炎性。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,曲东²,任杰³;指导教师:李煜生]]> 107true 【目的】 从成人骨髓中分离出Muse细胞,体外诱导成神经前体细胞,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。 【方法】 利用密度梯度离心和差速贴壁法从健康成人骨髓中分离、培养骨髓基质干细胞,通过免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪技术对其进行鉴定;体外扩增、传代6次后利用Muse细胞特征性的SSEA-3/CD105分子表型阳性,通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出Muse细胞并进行体外培养,观察其干细胞成球特性;对Muse细胞进行胰蛋白酶孵育,分析其应激耐受能力;利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞的多能干细胞标记物表达情况;通过在培养基中添加成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等对Muse细胞向神经前体细胞方向进行体外诱导,观察神经前体细胞的干细胞成球情况,利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术对其进行表型鉴定并观察神经前体细胞标记物的表达情况。 【结果】 从成人骨髓中分离出骨髓基质干细胞,免疫荧光细胞化学检测和流式细胞仪检测结果显示CD90表达阳性、CD45和CD11b表达阴性;通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出约0.5%的Muse细胞进行培养,细胞聚集成球,悬浮生长,表现为胰蛋白酶耐受;免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示Muse细胞表达多能干细胞标记物Nanog、Oct4、Sox2阳性;体外诱导Muse细胞向神经前体细胞方向分化,观察到细胞成球现象,免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示诱导后细胞表达神经前体细胞标记物nestin、βIII-tubulin。 【结论】 从成人骨髓中成功分离出Muse细胞,具有多能干细胞特性,经体外诱导形成神经前体细胞,为以后组织工程移植修复神经损伤提供新的种子细胞。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,马萌²,吴煜祺³;指导教师:陈雪, 王晓冬]]> 106true 【目的】 观察β-1,4-半乳糖基转移酶V(β1,4 galactosyltransferase V,β-1,4-GalT V)在生理病理状态下体内外施万细胞中的表达情况,探讨β-1,4-GalT V在体内外施万细胞中可能存在的生物学作用。 【方法】 (1)制备大鼠坐骨神经夹伤和切断模型,利用足迹试验观察坐骨神经功能指数(sciatic functional index, SFI);应用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)建立炎症模型。通过real-time PCR方法,分析β-1,4-GalT V mRNA在损伤及炎症性大鼠坐骨神经中的表达。利用RT-PCR扩增β-1,4-GalT V基因,克隆至pGEM-T载体,经体外转录法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT V RNA探针。通过原位杂交及图像分析,观察β-1,4-GalT V mRNA在大鼠正常、损伤及炎症坐骨神经中的表达变化。采用原位杂交与免疫组化相结合的方法检测β-1,4-GalT V的具体细胞定位。(2)利用RNAi和细胞转染等技术干扰β-1,4-GalT V在施万细胞中的表达,运用Lectin Blot检测施万细胞在生理和病理状态N寡糖链合成情况。 【结果】 (1)β-1,4-GalT V mRNA在坐骨神经夹伤后2 周与切断1 周时表达水平明显增高,与正常对照组及其他各组相比,差异有统计学意义(P<0.05),原位杂交结果显示β-1,4-GalT V主要表达于S100阳性的施万细胞中。β-1,4-GalT V mRNA的表达水平与体内炎症模型中LPS作用的浓度和作用时间有关,具有剂量和时间依赖性。(2)体外细胞培养时β-1,4-GalT V mRNA的表达水平及N糖链的合成也与LPS的作用时间和作用浓度有关。干扰β-1,4-GalT V的表达后可明显抑制N糖链的合成。 【结论】 β-1,4-GalT V主要定位于施万细胞中,与正常生理状态下的施万细胞相比,无论是坐骨神经损伤或炎症等病理状态下体内的施万细胞,还是LPS处理的体外培养的施万细胞,其β-1,4-GalT V的表达均有不同程度的变化,提示β-1,4-GalT V在施万细胞的生理病理过程均发挥重要的作用。干扰了施万细胞中β-1,4-GalT V表达后其N糖链的合成也显著减少,证实了β-1,4-GalT V与N糖链的合成密切相关。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,吴珊珊²,张洁²,张铭³,田桂香¹;指导教师:陈雪, 王晓冬]]> 105true 【目的】 探讨Glu对NSCs向神经元分化的影响。 【方法】 分离培养孕15 d SD大鼠皮质NSCs,将传至第4代的NSCs行NR1细胞流式分析并以1×10⁵个/mL的密度,接种于置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板各孔内分化培养,分为control、Glu、Glu⁺MK-801(0 h)(0 h加MK-801)、Glu⁺MK-801(24 h)(24 h加MK-801)组培养1、3、7、14 d后行DCX/Hoechst、TUNEL/Hoechst、MAP-2/Hoechst免疫荧光双标检测。 【结果】 43%的NSCs NMDA受体主要功能亚基NR1阳性;1 d时Glu组、Glu⁺MK-801(24 h)组DCX神经元前体细胞明显多于control、Glu⁺MK-801(0 h)组,3 d时MK-801(24 h)组DCX神经元前体细胞最多,Glu组DCX神经元前体细胞数量有所下降,但多于其余两组,至7 d时MK-801(24 h)组DCX神经元前体细胞仍较多,Glu组DCX神经元前体细胞与其余两组差异无统计学意义,14 d时4组几乎未见DCX神经元前体细胞,MAP-2/Hoechst免疫荧光双标检测,MK-801(24 h)组MAP-2阳性神经元明显多于其它3组;TUNEL/Hoechst免疫荧光双标显示:3、7、14 d时Glu组TUNEL凋亡细胞明显多于其它3组。 【结论】 Glu可通过NMDA受体促进NSCs向神经元分化,并在神经元成熟过程中促进其凋亡,此作用可被MK-801阻断。]]> 2014/12/11 10:03:24 104true 【目的】 探讨DNMT1和其特异性miRNA二者在Hcy致泡沫细胞形成过程中的作用,阐明特异性miRNA与DNMT1相互调控的分子机制。 【方法】 培养THP-1单核源性泡沫细胞,油红O染色鉴定;生物信息学预测调控DNMT1的特异性miRNA;运用qRT-PCR和Western Blot检测不同浓度Hcy(0、50、100、200、500 μmol/L)及100 mol/L Hcy+叶酸+维生素B₁₂(H+F+V)干预泡沫细胞后,miR-148a和DNMT1的表达。使用慢病毒miR-148a mimic和inhibitor分别过表达和抑制miR-148a,检测其对DNMT1表达的影响;针对miR-148a与DNMT1特异性结合的碱基位点,构建野生型(Wt)和突变型(Mut)的3'UTR荧光素酶报告质粒,与miR-148a mimic共转染,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测DNMT1荧光素酶活性。采用胆固醇检测试剂盒分析miR-148a过表达或抑制后对细胞内胆固醇含量的影响。用100 mol/LHcy干预泡沫细胞,通过甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测miR-148a启动子区甲基化改变,同时构建DNMT1重组质粒并感染泡沫细胞,检测DNMT1过表达后miR-148a启动子区DNA甲基化变化。 【结果】 分析提示调控DNMT1的特异性miRNA为miR-148a;不同浓度Hcy干预泡沫细胞后,DNMT1表达降低,miR-148a表达升高,以100 μmol/L Hcy组改变最为明显,差异均有显著性(P<0.05);给予100 μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12后上述情况改善(P<0.05)。过表达miR-148a后DNMT1 mRNA和蛋白水平明显下降,而抑制miR-148a后DNMT1 mRNA和蛋白水平明显升高,差异均有显著性(P<0.05)。将WtDNMT1 3'UTR荧光素酶报告质粒与miR-148a共转染,荧光素酶活性显著下降(P<0.05);将MutDNMT1 3'UTR荧光素酶报告质粒与miR-148a共转染,荧光素酶活性无明显改变。提示miR-148a可能通过与DNMT1的mRNA 3'UTR碱基UGCACUG发生互补配对结合,从而靶向抑制其表达。过表达miR-148a后,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量明显增加;沉默miR-148a后,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量明显降低(P均<0.05);而细胞内胆固醇酯含量无明显变化。给予100 μmol/L Hcy干预泡沫细胞后,miR-148a甲基化呈显著下降趋势;给予叶酸+维生素B12干预后,miR-148a甲基化水平较Hcy显著升高(P均<0.05)。过表达DNMT1后,miR-148a启动子区DNA甲基化水平升高(P<0.05)。 【结论】 miR-148a是DNMT1的特异性miRNA,其可能通过直接与DNMT1 3'UTR部分碱基序列UGCACUG发生互补配对结合影响DNMT1表达;miR-148a可通过增加泡沫细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量参与Hcy致泡沫细胞的形成过程;DNMT1在miR-148a启动子区甲基化过程中发挥重要作用。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,马媛²;指导教师:徐华, 姜怡邓, 田珏, 马胜超]]> 103true 【目的】 探讨ERO1α DNA甲基化和组蛋白甲基化相互作用调控ERO1α基因表达介导同型半胱氨酸致肝脏脂代谢紊乱的分子机制。 【方法】 建立apoE-/-小鼠HHcy模型,分为对照组、ApoE-/-对照组、HHcy组和干预组。检测肝脏脂质沉积情况、TC、TG及DNMT1含量、ERO1α 及G9a的表达;ntMS-PCR法检测ERO1α DNA甲基化改变;CHIP-qPCR法检测H3K9me2含量;不同Hcy刺激HL-7702肝细胞,验证ERO1α表达及甲基化程度;构建ERO1α和DNMT1的重组表达及沉默载体,检测肝细胞内TC和TG含量变化;AZC及Bix01294干预细胞后,分别检测H3K9me2表达及ERO1α甲基化水平。 【结果】 HHcy组小鼠肝脏脂质面积和血脂水平显著高于对照组,TC、 TG与其血清Hcy水平呈正相关。与对照组相比,各组中ERO1α的表达下降,与HHcy组相比,干预组中ERO1α表达升高,均与蛋白检测结果趋势一致;HHcy组DNMT1及G9a表达显著高于对照组,HHcy组中ERO1α甲基化水平及H3K9me2显著高于对照组。各组中ERO1α的表达逐渐下降,与Hcy呈浓度依赖关系;其中,与100 μmol/L Hcy组比较,叶酸组中ERO1α的表达升高,差异有统计学意义。分别过表达和沉默ERO1α并以Hcy作用后,与对照组相比,ERO1α过表达组TC和TG分别下降48.5%和38.1%,沉默组分别增加39.3%和46.4%。分别过表达和沉默DNMT1,结果显示,与对照组比较,过表达DNMT1后ERO1α甲基化水平增加15.9%,沉默组则下降55.9%,差异均有显著性。AZC抑制DNMT1并以Hcy干预后,抑制剂组与100 μmol/L Hcy组比较,ERO1α DNA甲基化水平降低了51%,H3K9me2水平随之降低;Bix01294干预后,100 μmol/L Hcy+Bix01294组与100 μmol/L Hcy组比较ERO1α启动子区H3K9me2水平降低,ERO1α甲基化水平随之降低。 【结论】 HHcy调控ERO1α启动子区DNA甲基化,和组蛋白甲基化相互作用导致ApoE-/-鼠肝脏脂代谢紊乱。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,刘向明¹,丁宁¹,刘蓉蓉²,王燕²;指导教师:张鸣号, 聂黎虹, 田珏, 马胜超]]> 102true 【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。]]> 2014/12/11 10:03:24 1,邹伊舟¹,姜晨晨¹,杨慧¹,晁凡²,管文敏³;指导教师:张鸣号, 聂黎虹, 田珏, 马胜超]]> 101true 【目的】 建立模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化的模型,从P16和RASSF1A基因甲基化和GADD45α、DNMTs蛋白表达的角度,研究模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化的分子机制。 【方法】 CCK8法确定模拟日光UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的单次辐射剂量;Gimsa染色从细胞形态角度初步确立模拟日光UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的终点;软琼脂克隆形成实验、明胶酶谱法检测MMP-9蛋白酶的分泌确立UVB辐射诱导人HaCaT细胞恶性转化模型的成功建立。实验设计分为2组:正常对照组、模拟日光UVB模型组。RT-PCR检测甲基转移酶DNMTs(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)mRNA的经时表达;蛋白质印迹法检测GADD45α、DNMT3b、P16及RASSF1A蛋白经时表达。高分辨率熔解曲线(MS-HRM)检测P16、RASSF1A基因甲基化程度的经时改变。收集每4次辐射后的结果进行讨论。 【结果】 UVB单次辐射剂量10 mJ/cm²×20次,成功建立模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化模型;首次通过 (DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)mRNA的经时表达证实模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞中DNMT1和DNMT3a的表达量与UVB辐射前相比无统计学差异,而DNMT3b的mRNA和蛋白的表达与辐射前相比随辐射次数增加逐渐升高,辐射20次后其表达量达到高峰(P<0.05);GADD45α蛋白的经时变化显示UVB辐射4次时即可检测到其表达量达到高峰,随后其表达量随辐射次数增加逐渐下降,辐射20次后其蛋白表达达到低谷(P<0.05);P16和RASSF1A蛋白的经时变化显示随UVB辐射次数增加其蛋白表达量逐渐下降,UVB辐射20次后P16和RASSF1A蛋白表达达到低谷(P<0.05)。 【结论】 在国际上首次建立模拟日光UVB辐射诱导的人HaCaT细胞恶性转化模型,揭示P16和RASSF1A基因的高甲基化与HaCaT细胞恶性转化密切相关,并且是DNMT3b和GADD45α参与调控P16和RASSF1A基因的高甲基化,而不是DNMT1和DNMT3a。]]> 2014/12/11 10:03:25 100true 【目的】 体外模拟角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC)的发育过程,利用生长因子和细胞外基质构建微环境,制备适当的条件培养基诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)分化为CEC。 【方法】 用丝裂霉素C处理胚鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs),接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。hESCs接种于MEFs饲养层,传代并免疫荧光鉴定。分割hESCs克隆团块,用拟胚体(embryonic bodies, EBs)培养基悬浮培养形成球形的EBs。用丝裂霉素C处理角膜基质细胞,接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。EBs接种于膜基质细胞饲养层,将SV-40转染的人晶状体上皮细胞接种于transwell小室与EBs共培养,EBs逐渐分化形成类角膜内皮细胞。环钻钻取新鲜猪眼球中央角膜片,脱细胞处理后,机械切取脱细胞猪角膜基质(acellular porcine cornea matrix, APCM),即获得APCM支架。倒置显微镜下剖切APCM后板层,甘油脱水。将hESCs来源的类角膜内皮细胞接种于APCM后弹力层表面构建CEC植片,培养7 d。 【结果】 hESCs培养6 d后可于饲养层上形成类圆形克隆团,在悬浮培养基中悬浮培养形成EBs。EBs于角膜基质成纤维细胞饲养层上与人晶状体上皮细胞系共培养,EB面积逐渐增大,中央部分形态发生变化,形成单层排列的多边形细胞。免疫荧光检测,可表达类角膜内皮细胞标记物Na⁺/K⁺ ATPase。类角膜内皮细胞接种于APCM支架培养,H-E染色证实后弹力层表面形成单层类角膜细胞结构。 【结论】 目前已经完成了hESC、人角膜基质成纤维细胞和人晶状体上皮细胞系的培养。实现了hESCs向角膜内皮细胞的诱导分化。完成了APCM的制备和鉴定。并成功以hESC和APCM构建了组织工程角膜内皮植片。植片的功能有待动物实验进一步研究。]]> 2014/12/11 10:03:25 99true 【目的】 寻找并鉴定脑血栓患者阿司匹林用药前后差异表达的血浆特异蛋白,探讨阿司匹林与维生素D结合蛋白(Vitamin D binding protein,DBP)相互作用进而预防血栓形成的详细机制,筛选与DBP清除血栓作用相关的候选蛋白,形成网络级联。 【方法】 于潍坊市益都中心医院获取初发脑血栓患者血浆样本18例[男性9例,女性9例,平均年龄(58.11±7.95)岁]。将18例患者随机分为3组(性别、年龄相匹配),分别混合3组用药前后血浆样本,构建6组样品池。针对样品池进行蛋白质提取及定量后,行固相PH双向凝胶电泳(2-DE)。运用ImageMaster 2D Elite 6.0软件比对用药前后2-DE图谱,基于蛋白质点灰度与体积变化,选取差异表达蛋白质点行基质辅助激光解析电离化飞行时间质谱法(MALDI-TOF/MS)和串联质谱法(MS/MS)分析以鉴定蛋白质,并对差异蛋白应用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)软件构建生物信号网络图谱。运用蛋白质印迹法验证用药前后血浆中DBP和肌动蛋白(actin)的表达差异。应用免疫共沉淀法验证DBP与actin相互作用。 【结果】 针对考马斯亮蓝染色得到的2-DE图谱,ImageMaster 2D Elite 6.0软件共筛选出1 256个蛋白点,其中228个具有表达量的差异。筛选差异超过1.5倍的30个蛋白质点行质谱分析得到28项检测结果(比对概率分数大于55分的结果有意义),包括DBP及与DBP作用相关联的11种差异蛋白:actin、结合珠蛋白、Fibrinogen gamma chain等。蛋白质印迹结果发现,DBP用药后(114.04±16.69)较用药前(66.33 ±5.61)表达显著上调,actin 则由(185.39±3.09)下调至(99.34±10.65)(两者P均 <0.01),与2-DE结果相一致。免疫共沉淀结果证实DBP与actin可直接作用,形成复合物。 【结论】 脑血栓疾病具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点,本实验采用临床样本,针对阿司匹林与DBP在预防血栓形成作用机制中的争论点,首次在中枢系统发现阿司匹林与DBP存在相互作用,使DBP表达上调,从而结合血浆actin防止其进一步聚合,发挥预防血栓形成的作用,DBP可作为预防心脑血管血栓性疾病的靶点应用于临床实验与治疗。此外,本实验筛选出DBP作用相关蛋白质,通过IPA显示Fibrinogen gamma chain与AT-III作用直接相关,可为阿司匹林预防和治疗血栓形成提供作用靶点。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,李子全²,王苗苗¹,马永琛³;指导教师:刘师莲]]> 98true 【目的】 量子点(quantum dots)是一种半导体纳米晶体,具有其独特的光学和电子学性质,与有机荧光染料相比,其荧光光谱比较稳定、荧光强度高,激发量子点的激发波长范围很宽,且连续分布,所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点,量子点作为一种新型生物荧光探针已成功应用于生命科学领域。但是,量子点的免疫毒性问题一直是研究学者关注的问题。量子点作为外来物质,可能会导致机体产生一系列的免疫反应,其对巨噬细胞的影响迄今为止并未见相关报道。因此,本项目以巨噬细胞为研究对象,研究其对CdSe/ZnS量子点的摄取能力,以及摄取后对巨噬细胞活性以及功能的影响。 【方法】 本项目通过Confocal成像观察巨噬细胞对 CdSe/ZnS量子点的摄取和定位,同时采用流式细胞术检测巨噬细胞对CdSe/ZnS量子点的摄取率;其次,利用MTT法检测量子点摄取对巨噬细胞活力的影响;最后,通过real-time PCR和ELISA法检测量子点摄取后对巨噬细胞不同细胞因子转录水平和分泌水平的影响。 【结果】 量子点作用2 h后可以被巨噬细胞摄取,摄取后分布在细胞浆内;量子点浓度对细胞活性有影响;1.25 nmol/L 影响不显著,但2.5 nmol/L影响显著。量子点可提高巨噬细胞IL-6与TNF-α的转录水平,对IL-2、IL-12的影响不显著;量子点对巨噬细胞IL-6与TNF-α分泌量的影响不显著。 【结论】 高剂量的CdSe/ZnS量子点可降低巨噬细胞的活力,但并不显著影响巨噬细胞的免疫反应功能。本项目首次研究了CdSe/ZnS量子点对巨噬细胞的影响,可为CdSe/ZnS量子点细胞毒性研究方面提供新的理论依据,有助于推进CdSe/ZnS量子点在医学上的实际应用。]]> 2014/12/11 10:03:25 97true 【目的】 50岁以上的妇女的骨质疏松发病率高达70%,黄韧带骨化主要累及老年人,65岁以上亚洲人的发病率达40%。两者均好发于老年人,然而黄韧带骨化患者均无骨质疏松现象。本研究目的利用miRNA微阵列芯片检测骨质疏松、黄韧带骨化患者以及正常人的血清差异miRNA。为研究黄韧带骨化、骨质疏松等老年骨骼系统疾病的发生机制、早期诊断及治疗提供有益的线索。 【方法】 收集5例骨质疏松、5例黄韧带骨化患者以及5例正常人群的血清。提取血清总RNA,经质控合格后,利用miRNA微阵列芯片技术筛选骨质疏松、黄韧带骨化患者与正常对照的血清标本中的差异表达的miRNA。 【结果】 以fold-changge>2、P>0.05为标准,与正常对照人群血清miRNA比较,黄韧带骨化患者血清中有17个miRNA表达明显上调,3个miRNA明显下调,骨质疏松患者血清中有11个miRNA表达明显上调。miRNA21、24为黄韧带骨化与骨质疏松患者血清的共同差异miRNA。 【结论】 本研究初步筛选出黄韧带骨化、骨质疏松与正常人群相比的差异表达的miRNA,为miRNA对黄韧带骨化和骨质疏松的筛查、早期诊断提供有益线索。并且发现两组疾病血清中存在的共同差异miRNA:miRNA24、miRNA21。两者在黄韧带骨化表现为下调,在骨质疏松表现为上调。提示miRNA21、24可能在黄韧带骨化和骨质疏松的发生、发展过程中起重要作用,为黄韧带骨化和骨质疏松等老年骨骼系统疾病的治疗提供新的思路。]]> 2014/12/11 10:03:25 96true 【目的】 当机体代谢生成的活性氧簇超过了抗氧化系统的清除能力,可引起氧化应激而与心血管疾病、炎症、肿瘤等发生密切相关。甲硫氨酸亚砜还原酶A (methionine sulfoxide reductase A, MsrA)能够特异还原被氧化的甲硫氨酸, 是细胞内一道重要的蛋白抗氧化防御屏障。导师课题组曾构建大肠杆菌表达系统并获得人源性MsrA(hMsrA),证实其在体外的抗氧化作用。本课题试图利用酵母表达体系表达一种具有细胞穿膜活性的分泌型Pep-1-hMsrA,为进一步研究 MsrA 对细胞的抗氧化保护机制奠定基础。 【方法】 利用基因克隆技术,合成含有细胞穿膜肽的pUC19/pep-1载体,双酶切将Pep-1序列连接到pET28a/hMsrA质粒上,构建pUC19/pep-1-hMsrA,再双酶切亚克隆到酵母表达载体获得pPICZ9k/pep-1-hMsrA重组质粒。经线性化的质粒电转化导入毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选、PCR鉴定拷贝数,构建新的hMsrA酵母表达体系。经甲醇(0.5%V/V)诱导表达,SDS-PAGE鉴定发酵液中Pep-1-hMsrA融合蛋白的产量,利用Ni-NTA Agarose亲和层析分离纯化目的蛋白,蛋白质印迹法鉴定融合蛋白的细胞穿膜效率,利用特异荧光底物鉴定融合蛋白的催化活性。 【结果】 成功构建pPIC9k/Pep-1-hMsrA重组质粒,并筛选出17株表达Pep-1-hMsrA的GS115工程株。诱导表达并纯化的目的蛋白产量约为30~40 mg/L,SDS-PAGE显示MW为约50 kD的单一条带,糖染色表明目的蛋白糖基化。蛋白质印迹法鉴定纯化蛋白有免疫原性,并具有特异还原活性。 【结论】 建立了Pep-1-hMsrA重组蛋白的酵母表达体系,纯化的Pep-1-hMsrA存在高度糖基化可能影响其催化活性,有待进一步研究此MsrA融入蛋白的结构与功能。]]> 2014/12/11 10:03:25 95true 【目的】 前期,课题组在临床工作中发现了一个X性连锁少汗型外胚层发育不良(XLHED)疑似患者家系。该家系共四代24例,男性15例,女性9例,患者4例。鉴此,课题组拟通过分子水平的研究,分析鉴定该家系的致病基因和遗传突变,探讨可能的分子致病机制,为疾病的预防与治疗奠定一定的基础。 【方法】 课题组对该家系资料进行了收集和整理,绘制出了遗传图谱。本课题对疾病家系中所有患病及未患病个体进行了详细的临床检查,并获得患者口腔的临床和X线照片。遗传分析中课题组运用直接测序的方法对候选致病基因进行序列分析,并与300例正常对照人群的基因序列进行序列比对。 【结果】 在该家系中,4例患者均为男性,另有5例女性确认为是携带者。测序结果显示,所有患者和携带者中EDA基因的第220个密码子发生点突变(C→T),造成密码子CCA转变为CTA,对应的氨基酸残基由脯氨酸转变为亮氨酸。同时,在该家系的其他健康成员以及随机选取的300例正常对照人群中均未检测到该突变。 【结论】 XLHED是一种X连锁的遗传疾病,目前研究发现XLHED的发生发展与3个基因有关,分别是位于Xq12-q13.1的EDA、位于2q11-q43的EDAR和位于1q42.2-q43的EDARADD。本XLHED家系是由EDA基因突变引起的。已知EDA蛋白具有4个功能区,包括:跨膜区、弗林蛋白酶切割位点、(Gly-X-Y)19胶原样结构域、TNF同源结构域。其中(Gly-X-Y)19胶原样结构域及TNF同源结构域位于细胞外,构成细胞外C末端结构域。本课题组所鉴定的突变c.659C>T是一个新的,且从未被报道过的错义突变。在19个(Gly-X-Y)胶原样结构域中,本次鉴定的突变发生在第13个(Gly-X-Y)的Y位,造成脯氨酸残基被亮氨酸残基替代。由于脯氨酸和亮氨酸侧链基团的差异,很可能造成肽链上该位点之后氨基酸残基的空间走向改变,影响EDA蛋白的空间构象,进而造成EDA-EDAR结合障碍,使之无法有效激活NF-κB的信号传导途径。进一步阻断或削弱了外胚层发育所必须的基因表达。本课题的完成将进一步丰富EDA基因突变谱,并为XLHED致病机制的研究提供新思路和新线索。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,陶昱²,李海瑞¹,王碧媛¹,蒋子剑¹;指导教师:马捷]]> 94true 【目的】 本实验旨在探究microRNA参与调控E3大鼠高脂饮食诱导的代谢综合征(HFD-MetS)模型肝胰岛素受体(InsR)表达下降的分子机制。 【方法】 首先根据microRNA数据库预测并选择可能调控InsR表达的候选microRNAs, 用实时定量PCR法检测E3大鼠HFD-MetS模型肝中这些候选microRNAs的表达水平,选择与InsR mRNA表达呈负相关的关键microRNA。然后用该关键microRNA的模拟物和抑制剂瞬时转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919细胞24 h。无血清培养基培养4 h后,用100 nmol/L的胰岛素分别处理上述细胞0、5、15 min,用实时定量 PCR和蛋白质印迹检测InsR、AKT及磷酸化AKT的表达。最后,分别构建包含miR-497结合位点和突变结合位点的、野生型和突变型的胰岛素受体 mRNA 3'UTR区双荧光素酶报告基因载体(简称为野生型载体和突变型载体),用miR-497模拟物和抑制剂分别与空载体、野生型载体、突变型载体转染293T细胞、观察萤火虫/海肾虫荧光强度比值的相对改变。 【结果】 实时定量PCR及相关分析结果显示miR-497在E3大鼠HFD-MetS模型肝中表达显著上调,并与InsR 表达水平呈负相关。用miR-497模拟物瞬时转染CBRH-7919细胞24 h,InsR的mRNA和蛋白质表达水平与对照组相比显著下降,胰岛素处理5、15 min后在ser473 和Thr308位点磷酸化的AKT 与对照组相比也明显下降;而miR-497抑制剂瞬时转染后,InsR的mRNA和蛋白质及胰岛素处理后ser473 和Thr308位点磷酸化的AKT与对照组相比明显上调,这些结果说明miR-497负性调节了胰岛素受体表达。最后用miR-497模拟物分别与空载体、野生型载体及突变型载体转染293T细胞后,与空载体组相比,野生型载体组相对的萤火虫/海肾虫荧光强度比值明显下降,突变型载体组无变化,而用miR-497抑制剂分别与上述三种载体转染293T细胞后,野生型载体组结果恰相反、突变型载体组亦无变化;这些结果进一步提示miR-497可直接与大鼠InsR mRNA的3-UTR区结合。 【结论】 在E3大鼠HFD-MetS模型肝中上调的miR-497可能通过抑制胰岛素受体的表达而导致肝胰岛素抵抗的发生。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,李嘉熙¹,刘鹏²,张鹏³;指导教师:李冬民]]> 93true 【目的】 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,病变过程中单核-巨噬细胞通过分泌多种细胞因子促进炎症的发生,对AS的形成和发展起到重要的作用。因此抑制炎症性单核细胞的产生则成为预防和治疗AS病变的关键。本实验室的前期研究证明,油酰乙醇胺(oleoyethanolamide,OEA)作为高效过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)特异性内源性配体,能够抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的炎症反应,对预防和治疗AS具有良好的药理作用。Z-十八碳-9-烯-丙磺酰胺(N15)是一种新合成的化学药物,其化学结构与OEA相似,为OEA的衍生物,但具体药理作用尚未完全清楚。我们的前期结果表明,LPS 诱导后细胞中炎症因子IL-6、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达明显增加,N15干预后可降低LPS诱导产生的IL-6、MMP-2及MMP-9的蛋白表达水平,并呈现一定的剂量依赖性。在此课题中,我们采用人急性白血病单核细胞(THP-1),观察N15对LPS诱导的单核细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响,并考察N15的抗炎作用与PPARα受体的相关性,同时研究TLR-4信号转导通路在N15抗炎机制中发挥的作用,明确N15是否具有抑制炎症反应的生物活性,并进一步阐明其抗炎的相关作用机制,为其治疗AS提供理论依据。]]> 2014/12/11 10:03:25 92true 【目的】 胶原是治疗骨软骨缺损的一种常用生物材料,但目前所使用的胶原支架的结构大多为无序(random collagen scaffold),不利于自体干细胞向缺损部位迁移以进行缺损修复。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor,SDF-1)可能会促进间充质干细胞向软骨下骨迁移。本研究通过用有取向通道的胶原支架(radially oriented collagen scaffold)替代无序胶原支架并结合SDF-1促进干细胞向缺损部位迁移迁移,提高骨软骨缺损修复的疗效。 【方法】 采用胶原冻干和热交联制作了传统的无序胶原支架和有取向的胶原支架,分别用电镜对支架通道进行表征,并进行力学性能、细胞毒性和细胞增殖等检测;通过HE染色和CCK-8细胞计数检测骨髓间充质干细胞在支架内的迁移;建立新西兰兔骨软骨缺损模型,将两种胶原支架分别复合SDF-1移植到缺损部位,分别在6、12周收集样本,通过ICRS评分、Safranin O染色以及免疫组化染色检测软骨的再生情况。 【结果】 有取向胶原支架较无序胶原支架表现为更好的力学强度,两种支架对细胞增殖无明显影响。有取向胶原支架可以促进骨髓间充质干细胞的迁移,且能够被SDF-1加强。动物实验术后6周,经过有取向胶原支架结合SDF-1的治疗,关节软骨表面恢复较好,且以透明软骨居多,ICRS评分为16.33±0.47。而经过无序胶原支架和SDF-1治疗,关节软骨恢复较差,表面以纤维软骨居多,ICRS评分为3.70±0.29。术后12周,经过有取向胶原支架结合SDF-1的治疗,ICRS评分为17.00±0.82,优于无序胶原支架和SDF-1治疗,评分为10.13±0.66 (P<0.05)。免疫组化结果显示经过有取向胶原支架结合SDF-1的治疗,软骨骨化标志物COL1和肥大标志物MMP13表达均下降。实验结果表明结合有序胶原支架复合细胞因子SDF-1可促进骨软骨缺损部位新生软骨的生长,并抑制软骨细胞的钙化和肥大。 【结论】 有取向胶原支架复合SDF-1的移植是一种潜在可行的骨软骨缺损疗法。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,陶佳栋²,茅棋江¹;指导教师:欧阳宏伟]]> 91true 【目的】 纯化的香菇多糖(lentinan, LNT)为香菇子实体提取物中的有效成分,是兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂,在临床上有广泛应用。树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,激活T细胞应答并在抑制肿瘤的发生、发展和转移中起到重要作用,同时DC疫苗也在防止多种传染病和肿瘤治疗等方面展现广阔前景。我们在科研见习期间通过研究发现LNT对DC有显著调节作用。但是具体的机理不清,而且国内外未见报道。因此,我们立项对LNT影响小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 表型及功能的变化进行了如下系统研究。 【方法】 取6~8周龄C57BL/6小鼠,颈椎脱臼处死,于75%酒精中浸泡10~15 min,无菌手术取出四肢放入75%酒精中,剔去肌肉,剪掉骨头两端,用1 mL无菌注射器吸取RPMI1640反复冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,1 500 r/min,离心6 min,倒掉上清,加入1~2 mL红细胞裂解液1~2 min,用PBS洗3遍后重悬于含双抗和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中,接种于6孔板,24 h后弃去未贴壁细胞,再加入含GM-CSF、IL-4、双抗和10%FCS的RPMI1640,隔天半量换液,培养至对数期,加药刺激。LNT溶解于RPMI1640中,配制其浓度为50 μg/mL,然后加入培养至对数生长期的BMDCs细胞培养液中, 用RPMI1640培养作为空白对照组,10 ng/mL的LPS(Sigma)刺激培养作为阳性对照。分别应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪术、吞噬实验及酶联免疫吸附试验,检测酸性磷酸酶活性、细胞表型及细胞因子IL-12、IL-10及TNF-α含量。 【结果】 与RPMI1640对照组相比,LNT处理组(50 μg/mL)BMDCs酸性磷酸酶活性明显下降(P<0.01);表面关键膜分子CD80、CD86,CD40、CD83,MHC Ⅱ、和CD205的表达水平明显增高(P<0.01);吞噬FITC-dextran量(反映摄取抗原能力)减少(P<0.05);细胞上清液中IL-12、IL-10及TNF-α含量明显增高(P<0.01)。 【结论】 本研究表明适宜浓度的LNT能够显著促进BMDCs表型和功能成熟。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,李子健²,罗宇家¹,赵萱¹,张頔¹;指导教师:单风平]]> 90true 【目的】 存在于脑胶质瘤组织中的胶质瘤干细胞(GSCs)与恶性脑胶质瘤的发生、发展和复发密切相关。长链非编码RNA (lncRNA)的转录和功能失调能够参与肿瘤的发生发展。结直肠肿瘤差别表达基因(CRNDE)属于lncRNA,有报道CRNDE在胶质瘤组织中的表达上调。本项目旨在研究GSCs中异常表达的CRNDE是否影响GSCs的生物学行为及相关的分子机制。 【方法】 Real-time PCR检测GSCs和non-GSCs中CRNDE和miR-186的表达水平以及CRNDE对miR-186的成熟体、初级转录本和前体表达的影响。双荧光素酶报告基因实验验证CRNDE与miR-186以及miR-186与靶基因间存在靶向结合。RIP和RNA pull-down实验检测CRNDE与miR-186和Ago2之间的相互作用。CCK-8细胞活力检测、流式细胞术、transwell迁移、侵袭实验验证CRNDE和miR-186对GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。建立GSCs裸鼠移植瘤模型验证Lv-shCRNDE和Lv-miR-186单独或联合应用对人GSCs裸鼠移植瘤的生长及荷瘤鼠生存时间的影响。 【结果】 GSCs中CRNDE的表达较non-GSCs组显著上调;GSCs中miR-186的表达水平较non-GSCs组显著下调。沉默CRNDE显著抑制了GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭。通过生物信息学软件分析,预测到CRNDE与miR-186存在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验证明了CRNDE与miR-186的结合作用,明确了结合位点。在GSCs中,CRNDE能够结合Ago2,并与miR-186存在相互作用。下调GSCs中CRNDE的表达能显著上调miR-186的成熟体表达,而初级转录本和前体的表达均未见明显变化。过表达miR-186显著抑制了与GSCs增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白XIAP、noggin、MAPK1和PAK7的表达;沉默miR-186则显著上调了上述蛋白的表达。miR-186能够靶向结合XIAP、noggin、MAPK1和PAK7基因的3'非翻译区。沉默CRNDE后通过上调miR-186的表达,促进miR-186对靶基因XIAP、Noggin、MAPK1和PAK7的负性调控,抑制了GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭;过表达CRNDE结果则与之相反。与Lv-shCRNDE和Lv-miR-186单用相比,两者联合应用能够显著抑制人GSCs裸鼠移植瘤的生长,延长荷瘤鼠生存时间。 【结论】 CRNDE通过结合并负性调控miR-186的表达,减弱miR-186对靶基因XIAP、Noggin、MAPK1、PAK7的调节,影响GSCs的生物学行为。该研究能够为脑胶质瘤的治疗和药物研发提供新策略。]]> 2014/12/11 10:03:25 89true 【目的】 家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia, FH)主要是由于低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)基因突变而导致的常染色体显性遗传性疾病,其临床表现为多发黄色瘤、高水平血浆、低密度脂蛋白(LDL-C)、早发性冠心病等。本研究拟通过收集FH家系,并对其先证者及家系成员进行相关致病基因(LDLR、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶PCSK9)的检测和分析,明确这些家系的血脂基因型,同时为血脂类疾病诊断、治疗和临床遗传学的开展提供理论基础。 【方法】 收集20个左右FH家系先证者及家系成员的血标本,测定所有研究对象的总血脂(TC)、甘油三酯(TG)、LDL-C以及高密度脂蛋白(HDL-C)含量,记录患者及家系的详实临床数据资料。用Qiagen试剂盒从外周血提取基因组DNA并鉴定,运用多聚酶链式反应(PCR)结合直接测序方法,检测LDLR基因、PCSK9基因,将核苷酸序列分析结果与GenBank比对,运用MutationTaster、Poluphen-2、SIFT等软件对突变位点进行预测和鉴定,分析突变所导致的蛋白结构变化及其与血脂表型的相关性。 【结果】 (1) 临床收集了20个FH家系,每个家系中均存在多个(≥3)血浆TC和LDL-C水平明显增高的患者。 (2) 在13个家系中检测到LDLR基因突变,1个家系中检测到PCSK9基因突变(p.E670G)。(3) LDLR突变中,1个是新的缺失突变(c.2000_2000delG),1个是新的纯合点突变(p.F202S)。 (4)预测软件预测发现的LDLR新突变(c.2000_2000delG、p.F202S)均为致病突变,Swissmodel 建模显示c.2000_2000delG突变导致LDLR蛋白胞内区发生截断,而p.F202S突变导致LDLR配体结合域发生了改变,且患者血脂异常、黄色瘤等临床表现较其他家系患者更为明显。 【结论】 FH中60%左右为LDLR的突变。本研究发现了2个新的LDLR基因致病突变位点,且基因型和血脂表型密切相关。我们的发现扩充了LDLR基因的突变数据库,并为血脂临床遗传学的开展提供了理论支持。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,范亮亮²,黄皓²,郭帅²,刘宇星²;指导教师:项荣]]> 88true 【目的】 证明本实验室所制备的抗日本血吸虫表面蛋白(Sj29)的单克隆抗体可识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29),拓宽抗Sj29单克隆抗体的用途,为今后研发检测血吸虫病的通用型试剂盒打下基础。 【方法】 通过基因工程技术和分子生物学技术扩增曼氏血吸虫表面蛋白基因(Sm29)并与T载体连接,连接产物转化至感受态细胞(大肠埃希菌),挑取单菌落,摇菌,提质粒双酶切鉴定,测序,再将测序正确的Sm29基因与真核表达载体pEGFP-C2连接,构建重组真核表达质粒,再将该重组质粒转染至真核细胞COS-1中表达,荧光显微镜观测转染效率。最后用蛋白质印迹技术和细胞爬片免疫组化两种方法验证抗Sj29单克隆抗体和兔日本血吸虫感染血清能否识别Sm29蛋白。 【结果】 经酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,所得的条带的位置及大小均与目的基因的位置及大小相一致,并且目的基因测序结果的相似度为99%,其中1%突变的碱基为无义突变类型,对蛋白的表达没有影响。荧光显微镜下观察转染效率为30%~40%。用日本血吸虫表面蛋白(Sj29)和曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29)分别作为一抗进行蛋白质印迹,其结果显示此株抗Sj29单克隆抗体均能识别上述两种蛋白,并且其识别日本血吸虫表面蛋白(Sj29)的位置位于20 kd左右,而其识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29)的位置位于55 kd左右,这两种结果均符合预期结果。以抗Sj29的单克隆抗体和日本血吸虫感染的兔血清分别为一抗作免疫组化,其结果均呈阳性,其对照组分别以PBS和正常兔血清为一抗,结果均呈阴性。说明抗Sj29的单抗不仅可以识别Sm29蛋白,同时感染兔血清中的抗体也可以识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29),进一步提高了以后研发检测血吸虫病通用试剂盒的可行性。 【结论】 抗Sj29单克隆抗体能识别Sm29蛋白,为今后研发检测血吸虫循环抗原的通用型试剂盒打下基础。]]> 2014/12/11 10:03:25 87true 【目的】 研究新发病原体的感染途径和致病性。 【方法】 建立持续的病原体体外培养。筛选合适培养基,患者样本培养,并进行形态学观察;建立动物感染模型。实验小鼠用病原体培养物,经腹腔和经口两种给药方式感染。每天观察小鼠的基本情况,并定期收集小鼠粪便检查;小鼠死亡后解剖,取脏器进行大体观察、病变组织的病理学及免疫组织化学染色观察。 取培养物用真核生物小核糖体RNA通用引物和棘阿米巴通用引物进行PCR扩增。 【结果】 经口感染的小鼠全部存活,一般情况无显著变化。收集小鼠粪便,观察到与培养物中相似原虫。腹腔注射原虫的小鼠很快出现精神不振、活动度低以及食欲下降等表现,并在2 d内死亡。死亡小鼠解剖,大体标本观察:肝脏和肺脏色泽暗淡。H-E染色:小鼠的肺组织有大量的炎症细胞浸润,血管扩张,肺泡间隔因炎性水肿变宽甚至融合,并观察到较多的近似球形寄生物,也有长条不定形状结构。肝脏和肺脏出现小灶性的坏死。免疫组织化学观察:肺组织中观察到较多的黑褐色颗粒,肝脏中黑褐色颗粒少见。棘阿米巴通用引物PCR扩增得到的条带经测序显示为一种棘阿米巴(Acanthamoeba griffini)。经阅读文献,该棘阿米巴的形态与病变组织中所见长条不定形状结构相似,而球形结构不符合棘阿米巴的形态,该球形物可能未被扩增。 【结论】 该寄生物为原生动物,可能为混合种类感染,其中有A.griffini,而球形原生动物的分类地位仍不清楚。感染方式可能为经口感染,在某种条件下,可穿过肠壁血管造成其他脏器的病变。新病原体主要对肺脏和肝脏损伤严重,毒力较强,可致小鼠死亡。]]> 2014/12/11 10:03:25 86true 【目的】 全世界有1.7亿丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)携带者,其中80%以上的HCV感染会慢性化,由其所致的肝硬化、肝癌发病率逐年升高。针对丙肝,世界公认的方法是干扰素(interferon,IFN)治疗,但其副作用较多,且对部分患者疗效不佳。新近研究表明髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells, mDCs)功能失调可能是HCV感染慢性化的重要原因,但其具体机制尚不明确。胞内泛素剪辑蛋白A20,又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3,TNFAIP3),作为新近被发现的免疫负调控分子,可通过负反馈机制调控TNFR、RIG-1及TLR信号通路诱导的免疫反应,但目前其在HCV感染病程中的作用尚不清楚。本实验拟通过检测不同人群中mDC中A20表达及其对不同刺激的反应,同时分析其与相关免疫促进/抑制分子的关系,揭示mDC中A20分子在HCV慢性感染中的作用,为丙肝治疗提供新靶点。 【方法】 (1)收集健康及丙肝患者外周血并分为4组:健康组、未治疗组(HCV感染时间>1年)、治疗组(IFN-α治疗1~6个月)、持续病毒学反应组(丙肝治愈),分离外周血单核细胞并提纯mDC,用流式细胞术测定mDC纯度,用RT-PCR法测定各组A20 mRNA表达;(2)体外用poly-IC和(或)IFN-α刺激健康组及未治疗组mDC,用RT-PCR法测定A20表达;(3)处理同(2),用流式细胞术测定HLA-DR、CD86、CCR7、IL-10、IL-12等细胞因子的表达水平,分析A20与其相关性。 【结果】 与健康组相比,治疗组mDC中A20表达显著下降,另两组则无统计学差异。与健康组相比,单用poly-IC处理时,未治疗组A20水平下降不明显;而单用IFN-α或poly-IC+IFN-α处理则无上述差异。IFN-α刺激后各组mDC中A20、IL-12表达较未处理前下调,HLA-DR、CD86、CCR7则上调;A20表达水平与HLA-DR、CD86、CCR7及IL-12呈负相关,与IL-10正相关。 【结论】 HCV感染后mDC失能,其A20持续处在正常水平,阻碍免疫反应活化致使感染慢性化;该过程可能与HLA-DR、免疫共刺激分子CD86、CCR7及免疫活化因子IL-12表达下调,免疫抑制因子IL-10上调有关。相反,IFN-α可以改善mDC功能并下调A20表达,增强机体免疫功能、促进HCV清除。因此,A20沉默法可能成为丙肝治疗新策略。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,吴亚琼²;指导教师:张海锋, 贾战生]]> 85true 【目的】 我国是汉坦病毒所致肾综合征出血热发病情况最为严重的国家,作为传统预防措施的灭活疫苗在预防出血热发生中发挥了巨大的作用,然而仍存在免疫原性低,生产运输保存不便,免疫后机体不能获得长效免疫记忆能力等缺陷。为克服传统灭活疫苗的诸多不足,近年研究多集中在核酸疫苗的探索上。常规DNA疫苗表达的蛋白属内源性抗原,抗原提呈细胞(APC)启动MHCI类抗原加工途径,向CD8⁺T细胞提呈MHCI/抗原肽复合物,而CD4⁺T细胞不能被有效活化。溶酶体是外源性抗原加工途径MHCⅡ类分子器室(MⅡC)的重要组成部分。我们课题组利用溶酶体相关膜蛋白(LAMP)胞浆尾的靶向作用(可与内吞体/溶酶体膜结合并翻转其中),将汉坦病毒胞膜糖蛋白(Gn)基因插入LAMP分子luminal domain和transmembrane/cytoplasmic tail之间,使Gn直接进入MⅡC,从而实现内源性抗原的MHCⅠ类加工途径向MHCⅡ类加工途径的转化。由此,不仅可同时激活细胞免疫应答和体液免疫应答,还可获得较好的长效免疫记忆能力,保护机体免受汉坦病毒的感染和疾病的发生。 【方法】 构建质粒pVAX-Gn、pVAX-LAMP、pVAX-LAMP/Gn,转染293T细胞鉴定目的蛋白表达;高纯度去内毒素质粒免疫BALB/c小鼠,设立灭活疫苗对照组;通过间接ELISA和中和试验评价体液免疫应答;采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)与细胞杀伤试验共同评价特异性细胞免疫应答;夹心ELISA和实时定量PCR(qRT-PCR)检测攻毒后体内各组织病毒载量评价保护效力。 【结果】 成功构建载体并有效表达目的蛋白;实验组小鼠血清特异性抗体和中和抗体效价都明显高于各对照组,脾淋巴细胞特异性分泌IFN-γ和CTL杀伤活性亦均高于其他各组,体外结果表明:即使与传统灭活疫苗相比,特异性细胞与体液免疫应答均显著增强;体内攻毒试验显示,实验组小鼠体内无汉坦病毒特异性抗原检出,表明接种该疫苗可保护个体免受病毒感染;增强免疫观察到表位扩展,且仅在LAMP重组疫苗免疫小鼠组检测到长效记忆性免疫应答。 【结论】 汉坦病毒胞膜糖蛋白与人溶酶体相关膜蛋白嵌合基因疫苗能够获得良好的特异性免疫应答,同时具有很好的对抗病毒感染的保护效力和长效免疫记忆,这些都提示该新型汉坦病毒基因疫苗未来在临床上的应用前景。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,张格飞²,闫阔成³;指导教师:杨琨]]> 84true 【目的】 白色念珠菌是临床最常见的条件致病性真菌,能够引起多种疾病,然而随着唑类等药物长期大量使用,导致真菌耐药性普遍产生,成为临床治疗失败的主要原因。纳米银已经被证明具有抗菌活性,但是对白色念珠菌耐药菌株抗菌作用有限,因此本项目主要目的在于研究纳米银和唑类药物联用抗白色念珠菌耐药菌株作用及其作用机制。 【方法】 用电镜方法、紫外全波长扫描及zeta电位测定分析加入唑类药物对纳米银溶液稳定性的影响,体外抗菌实验采用微量稀释法,两药之间关系采用棋盘式微量稀释法并用FICI指数评价,用琼脂扩散法和杀菌曲线来进一步验证两药作用关系。细胞学作用机制解析包括从细胞学水平研究纳米银对白色念珠菌出芽及唑类药物促进纳米银粘附于白色念珠菌表面效应。分子机制解析包括从基因水平研究纳米银和唑类药物联用对麦角甾醇生物合成途径相关基因及细胞膜外排泵基因表达的影响。 【结果】 唑类药物的加入对纳米银系列物理化学表征没有明显影响。纳米银单用MIC是16~32 μg/mL,氟康唑及伏立康唑单用抗耐药白色念珠菌MIC分别是≥64和8 μg/mL。而当联合应用时,纳米银MIC是0.125~0.25 μg/mL,氟康唑MIC是0.125~1 μg/mL,伏立康唑MIC是0.125~0.5 μg/mL,FICI指数均<0.5。琼脂扩散法和杀菌曲线测定进一步确认纳米银和唑类联用抗白色念珠菌耐药菌株具有协同作用。细胞学机制方面联合用药减少了白色念珠菌出芽率,增加纳米银对白色念珠菌的粘附;分子机制方面,发现联合用药能显著降低麦角甾醇含量,并能增加ERG5、ERG6基因的表达。降低外排泵基因CDR1的表达。 【结论】 纳米银和唑类药物联用对耐药白色念珠菌具有显著的协同作用。本项目基于临床抗真菌耐药的现状,为寻找新的逆转真菌耐药的应对策略提供思路。]]> 2014/12/11 10:03:25 83true 【目的】 针对本研究小组首次发现的,大量临床分离的北京型结核分枝杆菌中SigK 操纵子RskA编码基因的特殊表达模式,比较其对细菌形态、生理、毒力等的影响并初步分析产生这种影响的分子机制。 【方法】 以课题组构建的重组海分枝杆菌为研究对象,比较分析细菌体外培养、THP1细胞内培养、小鼠感染模型内形态、生长能力及毒力特征。检验重组细菌一线、二线抗结核药物的耐受性。采用qRT-PCR方法检测相关基因的表达水平,分析SigK操纵子表达与机体内环境的关系。利用比较蛋白质组学技术,寻找与SigK操纵子RskA E83D突变相关的蛋白调控网络。 【结果】 RskA E83D突变会抑制细菌在低氧状态以及贫营养状态下的生存能力,同时抑制在THP1胞内的生存能力。改变细菌中部分一线、二线抗结核药物靶基因的表达水平,从而影响药物抗性。RskA E83D突变蛋白高水平表达菌株感染的小鼠28 d后肺、脾组织结构中出现了明显淤血和水肿,并伴有大面积炎症细胞浸润,导致菌株致病力增强。 【结论】 北京基因型结核分枝杆菌RskA E83D这种突变可能会影响SigK/RskA的相互结合,影响SigK的表达,并最终改变高度免疫原性蛋白MPT83、MPT70的分泌水平。本研究的进行有助于揭示SigK特殊的调节机制,以及这种调节机制对临床菌株的流行病学播散、细菌耐药性、致病性的影响。]]> 2014/12/11 10:03:25 82true 【目的】 以广西医科大学基础医学院2011级学生为对象,调查这部分人群足部真菌感染状况并分离鉴定病原体,为手足癣真菌病的流行病学研究及开展相关预防措施提供参考。 【方法】 采用自编问卷进行调查,对57份样本,分别进行真菌培养、菌种鉴定,得出样本培养阳性率和真菌镜检阳性率。 【结果】 (1)足部真菌感染患病情况:444例广西医科大学基础医学院2011级学生患有足部真菌感染性疾病者169例,患病率为38.1%。其中男生患病率为43.3%,女生患病率为35.6%,男、女生患病率差异无统计学意义(χ²=2.382,P=0.304)。(2)对足部真菌感染疾病的了解情况:对足部真菌感染疾病十分了解的学生占4.0%,不是十分了解的学生占64.9%,不了解的学生占31.1%;其相应的患病率分别为61.1%、42.4%、26.1%;对足部真菌感染疾病的了解差异与患病率差异有统计学意义(χ²=15.474,P=0.04)。(3)真菌培养57份标本,共分离出49株真菌,培养阳性率为86.0%,其中男生为90.5%,女生为82.9%,男、女生样本培养阳性率差别无统计学意义(χ²=0.027,P=0.870 )。(4)菌种分布皮肤癣菌11株,占培养阳性率的22.4%(11/49),其中红色毛癣菌占18.2%(2/11),须癣毛癣菌占9.1%(1/11),石膏样小孢子菌占63.6%(7/11);酵母菌20株,占培养阳性的40.8%(20/49),以念珠菌属为主,占80%(16/20);霉菌20株,占培养阳性的40.8%(20/49)。]]> 2014/12/11 10:03:25 81true 【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,刘静涛¹,熊攀¹,朱立伟¹,熊梦源²;指导教师:郭阳]]> 80true 【目的】 研究黄芩对肺炎克雷伯菌体外生长、生物膜形成能力及耐药性的影响。 【方法】 制备黄芩药液,以多重耐药肺炎克雷伯菌为试验菌株,平板法检测黄芩液对该菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。培养基中分别添加1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MI黄芩液,与未添加黄芩液作对比,通过紫外分光光度计检测OD600值,绘制细菌生长曲线,了解黄芩是否抑制肺炎克雷伯菌的生长。48孔培养板中建立肺炎克雷伯菌体外生物膜模型,建模初期实验组分别加入黄芩液使其终浓度为1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC,与空白对照组于1、3、7 d进行激光共聚焦显微镜检测,观察黄芩液对肺炎克雷伯菌黏附、生物膜形成时间、厚度以及形态的影响。细菌培养与药敏实验中分别加入0、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC黄芩液,检测细菌对抗生素的敏感度。 【结果】 平板法检测黄芩液对肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分别为32 mg/mL和64 mg/mL。在不同浓度黄芩液作用下,肺炎克雷伯菌速度均有不同程度的减慢,其中以1/2MIC浓度减慢最为明显。体外生物膜模型试验显示,建模1 d和3 d时,实验组较空白对照组形成的绿色荧光生物膜减少;建模7 d,黄芩液终浓度为1/2 MIC实验组较空白对照组形成的绿色荧光生物膜有所减少,并出现大量红色死细菌,1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC浓度组与空白对照组相比形成的生物膜规模大体一致。药敏试验中,1/2 MIC、1/4MIC、1/8MIC实验组能逆转细菌对头孢类、喹诺酮类、单酰胺环类的新型β－内酰胺等抗生素的耐药性。 【结论】 黄芩可通过抑制肺炎克雷伯菌体外长、生物膜形成而抑制其生长,能增强耐药细菌对抗生素的敏感性。]]> 2014/12/11 10:03:25 1,陈宝杰¹,张勇¹,胡娟²;指导教师:欧琴]]> 79true 【目的】 间接凝集实验(IHA)是将抗原或抗体吸附于致敏红细胞表面作为检测试剂来检测标本中的相应抗体或抗原的血清学方法,是血吸虫病疫区应用最广泛的免疫学诊断方法。但由于其较低的敏感性和特异性、红细胞的批间差异以及较高的假阳性率等缺点,现场诊断价值大打折扣。IgY(Immunoglobulin of egg yolk)是鸡卵黄中的免疫球蛋白,相比哺乳动物的IgG,IgY可与抗原上的更多表位反应,放大信号,提高诊断敏感性。且其不与补体、抗体及人或细菌Fc受体等结合,减少了样本中无关因子的干扰从而避免假阳性或假阴性结果。本实验结合IgY的优点,引用IHA的原理,以工业化的纳米磁珠代替致敏红细胞避免批间差异,建立基于IgY的免疫磁珠间接凝集试验,用于检测血吸虫感染小鼠血清中的循环抗原,为检测血吸虫循环抗原提供一种新的技术。 【方法】 从血吸虫感染的兔肝脏中收集虫卵,制备可溶性虫卵抗原(SEA)。用SEA皮下免疫莱杭鸡,制备纯化抗SEA的IgY抗体,将抗SEA的IgY抗体与纳米磁珠偶联制成免疫磁珠。建立血吸虫感染小鼠模型,收集感染前后不同时间(2、4、6、8、10和12周)小鼠血清标本。按IHA的操作进行试验,检测感染小鼠血清中循环抗原。 【结果】 本实验成功制备了分子量为130 kDa的anti-SEA IgY多克隆抗体,该抗体可特异性地识别血吸虫SEA中140 kDa、100 kDa和69 kDa三种抗原成分。免疫磁珠间接凝集试验可检测出重度感染组感染后6周以及轻、中度感染组感染后8周血清中的循环抗原,并且血清反应的强度与小鼠感染度、感染时间呈正相关。 【结论】 本课题组成功建立了基于IgY的免疫磁珠间接凝集试验,此法可有效地检测出不同感染度小鼠血清中循环抗原。为血吸虫循环抗原的检测提供了一种高敏感性和特异性,操作简便快捷的诊断方法,可提高免疫诊断试验在血吸虫病防治活动中的实用价值。]]> 2014/12/11 10:03:26 78true 【目的】 通过我们前期建立的人博卡病毒 (human bocavirus,HBoV) 感染新型检测体系,分析HBoV在银川地区儿童急性肺炎患者中的流行情况,探讨HBoV感染在儿童急性肺炎的临床意义,为临床防治提供理论依据。 【方法】 采用我们自己研发的检测策略:首先对患儿呼吸道分泌物加入裂解液直接煮沸裂解,然后以裂解产物直接作为模板进行半巢式–聚合酶链反应(hemi-nested Polymerase Chain Reaction,hemi-nested PCR)进行扩增检测。收集2012年11月至2013年10月宁夏医科大学总医院儿科病房和儿科重症室179例因急性下呼吸道感染(临床诊断为肺炎)的住院患儿童的下呼吸道分泌物,采用上述检测策略进行检测,并通过测序进行验证。针对HBoV感染的阳性病例进行流行病学(感染年龄、季节、性别)及临床特点(肺炎类型、临床表现、X线检查)分析。 【结果】 179例因急性肺炎住院儿童的下呼吸道分泌物的检测,共检出48例HBoV感染病例,阳性率为26.81% (48/179);HBoV感染的高峰主要集中于11、12、1月份。HBoV阳性病例中,年龄分布主要以2岁以下年龄段为主,阳性比例占总阳性样本的85.42%(41/48);感染的男女性别分布上分别为25.17%,20.33%,无统计学意义(P>0.05)。HBoV感染与疾病的关系上,支气管肺炎最高,33例,占HBoV阳性病例68.75%。其次,肺炎7例,占14.58%;重症肺炎5例,占10.4%。HBoV感染患儿中.主要临床表现及实验室检查为:咳嗽(91.66%),喘息(83.33%),发热(77.08%),腹泻(33.33%),肺部啰音(89.58%),胸片异常(91.66%)。HBoV存在与呼吸道细菌的共感染现象,合并细菌感染率为42.22%(19/45),其中主要以铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌三种最为常见。 【结论】 利用我们开发的检测体系,在179例因急性肺炎住院儿童的的检测中, HBoV的阳性检出率为26.81% (48/179),HBoV感染主要分布在冬春季节。HBoV感染阳性率在男女间无差异,2岁以内是HBoV感染的高发阶段。HBoV感染的临床病例中以支气管肺炎最为常见,HBoV与细菌存在混合感染。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,张思敏²,李娜³;指导教师:孙玉宁, 姚青]]> 77true 【目的】 肺炎克雷伯菌是医源性感染的重要致病菌之一,随着临床大剂量抗生素的不规范使用,肺炎克雷伯菌多重耐药菌株日趋增多,常导致治疗的失败和病程迁延。I类整合子是肺炎克雷伯菌中分布最普遍的整合子,其携带的耐药基因盒在细菌耐药性方面起关键作用,且整合子的分布及携带的基因盒存在明显的地区差异性。目前尚未见青岛地区肺炎克雷伯菌整合子的研究报道,本研究旨在探讨I类整合子的分布、基因盒的组成及其与耐药表型的关系,明确青岛地区肺炎克雷伯菌中I类整合子及其携带的基因盒流行情况,为临床合理应用抗生素提供可靠依据。 【方法】 收集2011年至2013年青岛市立医疗集团分离鉴定的呼吸系统感染的非重复肺炎克雷伯菌82株,采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的K-B法测定细菌对16种常用抗菌药物的敏感性;提取细菌基因组DNA,PCR检测整合子保守区的整合酶基因;对保守区阳性的菌株进行可变区基因的PCR扩增,将回收纯化的PCR产物克隆至pMD18-T载体,经琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定后,重组克隆送往华大基因公司进行测序,通过在线Blast和DNA Star软件进行同源性比对分析,确定I类整合子携带的耐药基因盒。 【结果】 82株肺炎克雷伯菌对16种常用抗菌药物的耐药率为2.3%~72.1%,其中对头孢唑林、哌拉西林和头孢呋辛类药物的耐药率达60%以上;I类整合子的阳性率为76.82%,I类整合子可变区扩增片段大小从750~2 500 bp不等,测序结果显示其携带的11种基因盒主要包括编码氨基糖苷类耐药性的aad 家族(aadA1、aadA2、aadA5、aadB)、aac 家族(aacA4)、编码磺胺类耐药性的dfr家族(dfrA1、dfrA5、dfrA12)、编码氯霉素耐药性的catB8 基因及功能不明的orfF及orfC 基因,共组成7种不同的基因盒排列组合(已向GeneBank申请登录)。 【结论】 青岛地区呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中I类整合子的阳性率较高,其携带的耐药基因盒主要赋予细菌对氨基糖苷类和磺胺类的耐药性,这些耐药基因盒的不同排列组合构成了肺炎克雷伯菌多重耐药的物质基础。]]> 2014/12/11 10:03:26 76true 【目的】 乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是原发性肝细胞癌(HCC)发生的重要因素,HBV的复制与表达受宿主肝细胞内多种转录因子调控,寻找宿主细胞内抑制HBV启动子活性的转录因子,将为实现控制HBV复制、阻断HCC发生提供重要理论依据。研究证实,新型转录抑制因子ZHX2能抑制肝癌重要标志物AFP和GPC3的表达,并通过抑制cyclinA/E启动子,在HCC发生中发挥抑癌作用。本室前期研究发现HCC组织中ZHX2表达与HBcAb相关,然而ZHX2是否抑制HBV转录迄今尚未报道。本研究旨在探索ZHX2对HBV基因启动子活性的调控作用及其分子机制。 【方法】 设计引物,以pcDNA3-HBV1.1质粒为模板PCR扩增获得HBV不同启动子片段,克隆入pGL3-Basic,构建HBV启动子报告基因表达载体。ZHX2过表达载体分别与HBV不同启动子报告基因表达载体共转染肝癌细胞系HepG2.2.15、BEL7402、HepG2细胞,双荧光素酶报告基因检测启动子活性变化;干扰NF-YA后检测启动子活性变化。在HepG2.2.15细胞过表达ZHX2,ELISA、RT-PCR、蛋白质印迹法检测HBV基因转录表达。 【结果】 成功构建HBV核心启动子(core promoter, CP)、前S1区启动子(SPI)、前S2及S区启动子(SPII)和X基因启动子(XP) 的报告基因表达载体pGL3-CP、pGL3-SPI、pGL3-SPII、pGL3-XP。4种载体在不同细胞中均表现出良好启动子活性(P<0.05)。共转染及双荧光素酶报告基因检测结果显示,HepG2.2.15细胞内ZHX2过表达可明显抑制CP、SPII、XP活性(P<0.01);干扰NF-YA可抑制SPII 活性(P<0.05),并消除了过表达ZHX2对SPII启动子的作用,提示ZHX2通过抑制NF-YA下调SPII活性。蛋白质印迹结果证实了ZHX2的过表达效果;与对照组相比,ZHX2过表达组actin水平基本一致,提示ZHX2并非通过影响细胞增殖而调节HBV转录。ELISA结果显示,ZHX2转染6 h 后细胞上清中的HBsAg、HBeAg显著降低 (P<0.05);RT-PCR结果发现,ZHX2转染48 h后明显降低HBV pgRNA表达,进一步证明ZHX2能抑制HBV基因的转录活性。 【结论】 ZHX2能抑制HBV CP、SPII、XP启动子活性,并抑制HBV pgRNA的合成,降低HBV抗原表达,提示ZHX2在HBV相关疾病防治中的潜在价值。]]> 2014/12/11 10:03:26 75true 【目的】 鲍曼不动杆菌是一类非发酵、专性需氧的革兰阴性球杆菌,是临床常见的条件致病菌之一。近年来鲍曼不动杆菌感染率不断上升,其耐药率也逐年增强。鲍曼不动杆菌几乎对所有抗生素呈现高度耐药,给临床治疗带来极大困难。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒,具有严格的宿主特异性,只能在活的微生物细胞内复制、增殖。毒性噬菌体在宿主菌内复制增殖,并最终裂解细菌,其特殊的生物学特性有望成为临床上治疗细菌感染新的有效手段。温和噬菌体能将基因组整合于宿主菌染色体中,不产生子代噬菌体,不裂解细菌,使菌体处于溶原状态。本课题通过分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体,研究噬菌体对耐药性的鲍曼不动杆菌的影响。 【方法】 采集污水,人及动物上呼吸道内和医院ICU环境的标本,经CaCl₂处理后,离心取上清液,细菌滤器滤过,将滞留在滤膜上的细菌进行分离传代培养,纯化;染色镜检,观察细菌形态、排列,初步生化试验筛选、ATB生化鉴定菌种;药敏试验选择耐药菌株;经噬斑试验,分离或诱导毒性噬菌体;负染色法制备电镜标本,观察其超微结构。 【结果】 ICU环境中,特别是呼吸机导管可分离到鲍曼不动杆菌,鲍曼不动杆菌表面存在温和噬菌体,呈多边形,细菌耐药性明显,为多重耐药。 【结论】 耐药的鲍曼不动杆菌菌体表面存在温和噬菌体,未裂解细菌,可能将基因整合于宿主菌体,研究噬菌体与不动杆菌耐药性的相关性,通过诱导毒性噬菌体,裂解细菌,可治疗和控制细菌性感染,将为防治鲍曼不动杆菌引起的医院感染带来希望。]]> 2014/12/11 10:03:26 74true 【目的】 旋毛虫病是呈全球性广泛分布的食源性人兽共患寄生虫病。旋毛虫副肌球蛋白(trichinella spiralis paramyosin,Ts-Pmy)是本课题组首次发现的抗原蛋白。前期研究结果表明,该蛋白通过与补体膜攻击复合物(MAC)组分C9结合,阻碍MAC组装,使虫体逃避补体系统的杀伤。本课题将精确定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点,为深入研究Ts-Pmy免疫调节功能奠定基础。 【方法】 将Ts-Pmy分段表达为多个重组截短片段以及合成短肽,利用蛋白质印迹(Western-blot)和斑点印迹(Dot-blot)方法检测截短片段以及短肽与补体C9的结合能力,以定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点。通过对Zn²⁺诱导的补体C9聚合反应以及红细胞裂解实验,研究结合位点多肽的功能。进一步制备了抗结合位点多肽的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。在鉴定单抗的亚型、亲和力和特异性的基础上,通过单抗体外结合抑制实验和体内被动免疫保护实验鉴定单抗的功能。 【结果】 精确定位Ts-Pmy与补体C9的结合位点位于Ts-Pmy羧基端14个氨基酸残基的区域,即第866位缬氨酸至第879位甲硫氨酸(VSMGKSLSSKVYVM)。结合位点多肽可抑制Zn²⁺诱导的补体C9聚合反应以及红细胞的细胞溶解反应,具有与全长Ts-Pmy相似的功能。制备的mAb 9G3可与旋毛虫不同发育阶段的天然Pmy和重组Ts-Pmy特异识别,且能够抑制Ts-Pmy与补体C9的结合。通过小鼠尾静脉被动回输mAb 9G3,肌幼虫减虫率可达42.6%。 【结论】 精确定位了Ts-Pmy与补体C9的结合位点,获得的抗结合位点多肽的mAb 9G3是一株具有免疫保护性的抗体。上述研究为抗旋毛虫病疫苗及基因工程抗体的研制提供了精确的分子靶标。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,潘炜²,孙然³;指导教师:杨静, 诸欣平]]> 73true 【目的】 探讨公共场所空气中葡萄球菌的多样性,并追踪气载MRSA的来源,为预防和控制传染病的传播提供依据。 【方法】 用LWC-1型离心式空气微生物采样器采集医院、教室、车站等公共场所室内空气并分离鉴定其中的葡萄球菌;计算每个采样点的葡萄球菌的浓度;采用K-B纸片扩散法检测金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)对15 种抗菌药物的敏感性;进一步用头孢西丁纸片法检测其中的MRSA,采用REP-PCR扩增气载MRSA及其它医院源及动物源的MRSA的基因组DNA,用NTsys2.10e 软件,非加权配对法(UPGMA法)做遗传分析的树状图,进行聚类分析,探讨不同源MRSA分离株的遗传相似性,对MRSA进行追踪溯源分析。 【结果】 公共场所空气金黄色葡萄球菌浓度为35~97 CFU/m³,凝固酶阴性葡萄球菌49~102 CFU/m³;葡萄球菌气溶胶总浓度在车站中最高,为132 CFU/m³,其次为医院、教室和公园(P<0.05)。从空气中共分离纯化得到金黄色葡萄球菌 52株,其中MRSA共12 株,凝固酶阴性葡萄球菌 65 株;药物敏感试验结果显示气载葡萄球菌对氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类抗生素的耐药率较高(>85%);但均对万古霉素及替拉考宁敏感。46%的金黄色葡萄球菌和54%的凝固酶阴性葡萄球菌对三类或三类以上抗生素同时耐药,为泛耐药株;12株气载MRSA图谱显示菌株之间密切相关,相似性在50%~100%之间。气载MRSA与医院临床MRSA分离株之间的相似性在60%~100%之间;与动物源MRSA之间的相似性在40%~100%之间。 【结论】 公共场所的空气中存在着多种葡萄球菌的污染,并呈现多重耐药性;空气中的MRSA菌株与医院临床分离株及动物源的MRSA有着非常近的亲缘关系,个别菌株属完全相同的菌株繁殖而来,应加强空气中葡萄球菌尤其是多重耐药葡萄球菌的监测及防控。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,李丽伟¹,周芬芬²,王海峰³;指导教师:李晓霞]]> 72true 【目的】 研究肠菌移植对小鼠溃疡性结肠炎(UC)的治疗效果及相关指标的变化情况。 【方法】 以3%的葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液喂养BALB/c小鼠7 d进行UC造模,肛门出现明显的血迹后,以正常小鼠肠菌清液进行灌肠,7 d后停止;造模期间,每天定时对小鼠进行称重,做出体重变化曲线;常规PCR与实时定量PCR技术检测肠道菌群变化,做出柱状图;隐血实验:每天定时取小鼠粪便,以四甲基联苯胺法测隐血,做出折线图;病理组织诊断:取小鼠结肠组织做病理组织切片,H-E染色,观察病理组织变化并分析。 【结果】 造模期间观察体重发现,UC可致体重急剧下降,而行肠菌移植7 d,体重明显回升至正常水平;实时荧光定量PCR表明,造模期间益生菌(如:乳酸杆菌、双歧杆菌)减少,大肠杆菌增多,而行肠菌移植7 d,益生菌数量回升,大肠杆菌下落,说明肠菌移植能够调整肠道菌群分布平衡;造模期间可看到肛周明显血迹,即出现肉眼可见血便,而行肠菌移植7 d,肉眼血便消失,隐血试验结果也表明结肠不再出血;从病理组织切片来看,在造模期间,结肠的黏膜与黏膜下层受损,出现淋巴细胞、单核-巨噬细胞大量浸润,形成隐窝脓肿,隐窝脓肿融合破溃形成浅小溃疡,经过治疗后,再观察结肠组织切片,可发现黏膜已恢复,已达治愈标准。 【结论】 肠菌移植对于溃疡性结肠炎的治疗是有效的。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,吕佳昱²,张昊¹;指导教师:李海东]]> 71true 【目的】 流感病毒感染是严重威胁人类健康的传染性疾病,抗病毒药物的研究已成为人们关注的焦点。前期研究发现EGCG可显著降低流感病毒感染后细胞氧化应激水平及流感病毒感染后细胞自噬水平。因此,我们推测EGCG的抗病毒机制与药物自身抗氧化特性及与宿主细胞调控作用存在一定相关性。本研究通过体外流感病毒感染模型,进一步揭示EGCG抗流感病毒的分子机制。 【方法】 (1)通过MTS法评价EGCG、天然抗氧化剂、氧化应激激活剂的细胞毒性。(2)蛋白质印迹法检测流感病毒感染时ERK等通路的激活与转录因子NF-κB、重要促炎因子上调的关系;以ERK特异性抑制剂为对照,以细胞p-ERK1/2磷酸化水平、病毒滴度等为指标,研究药物对流感病毒感染后细胞ERK通路的影响。(3)选择天然抗氧化剂与活性氧激活剂,通过MTS法、实时定量PCR等方法评价其对EGCG的抗流感病毒作用,并通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞内活性氧水平。(4)用激光共聚焦显微镜、FCM检测药物对流感病毒感染后的EGFP-LC3质粒转染细胞表达的影响,病毒感染与药物处理前后自噬小体的水平,蛋白质印迹法检测自噬蛋白LC3等的表达,自噬标记物-NBR1和p62水平。 【结果】 (1)EGCG可显著降低宿主细胞内氧化应激的水平(54%),与病毒对照组相比较有统计学差异(P<0.05)。(2)给予不同浓度EGCG处理后的病毒感染细胞,蛋白质印迹法检测发现ERK2表达受到了明显抑制。(3)天然抗氧化剂能加强EGCG对甲型流感病毒的抑制作用,并降低宿主细胞内氧化应激水平的程度,这一作用与抗氧化剂的类型相关。(4)氧化应激激活剂对EGCG的抗病毒作用、降低氧化应激水平程度起拮抗作用。(5)甲型流感病毒感染A549细胞导致自噬蛋白LC3-II上调,而EGCG可显著降低细胞自噬水平。 【结论】 EGCG可通过抗氧化作用调控氧化应激,降低细胞自噬水平,从而抑制流感病毒导致的细胞凋亡,发挥抗病毒作用。]]> 2014/12/11 10:03:26 70true 【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。]]> 2014/12/11 10:03:26 69true 【目的】 白血病是一类造血系统恶性肿瘤,严重威胁人类健康。临床上可使用“注射用核糖核酸Ⅱ” 对白血病患者进行辅助治疗。该药是一种提取自牛胰腺的小分子RNA和多肽的混合物,但作用机制不清。本研究目的是通过miRNA芯片及生物信息学筛选,发现“注射用核糖核酸Ⅱ”中可能存在的具有抑制白血病细胞活性的miRNA,并研究其作用机制。 【方法】 应用microarray技术分析“注射用核糖核酸Ⅱ”药物中含有的人源miRNA。利用生物信息学技术和相关数据库预测其靶基因。通过Gene Ontology对靶基因进行功能富集。利用DAVID数据库进行KEGG信号转导通路富集分析进一步筛选出候选miRNA。利用CCK-8细胞活性检测试剂盒确定所选miRNA对白血病细胞生长的抑制作用。蛋白质印迹技术检测其相关靶蛋白的表达水平。用人外周血单个核细胞分离液分离CML及AML患者外周血白细胞并进行原代培养。CCK-8细胞活性检测试剂盒确定所筛选的miRNA对白血病原代细胞生长的抑制作用。 【结果】 应用microarray技术,从“注射用核糖核酸Ⅱ”药物中共检出23个人源miRNA。利用PicTar、miRanda和TargetScanS等数据库进行靶基因预测,筛选出了5个miRNA:miR-320a、let-7b、miR-Ⅱ、miR-494和miR-335。利用Cytoscape软件及其插件BiNGO对上述miRNA的靶基因进行了功能富集分析。DAVID工具进行了KEGG信号通路富集分析,最终选择了miR-Ⅱ进行进一步研究。miR-Ⅱ靶基因大多富集于转录因子调控、细胞凋亡、细胞增殖等信号通路。疾病信号通路主要富集于以慢性髓系白血病、急性髓系白血病、胰腺癌为代表的多种癌症,在各条信号通路中主要负责调控RAS、CyclinD、TGF-β等重要分子的表达。3种白血病细胞系(L1210、MEL和K562)体外实验显示,直接给予人工合成的miR-Ⅱ mimics自50 nmol/L起就可抑制白血病细胞活性,抑制率最高可达70%左右(300 nmol/L)且具有明显的剂量依赖效应。miR-Ⅱ对两种胰腺癌细胞系(PANC-1、AsPC-1)和一种正常细胞系(MDCK)无显著细胞毒性。AML(2位)、CML(1位)患者原代白血病细胞体外实验中,miR-Ⅱ具有一定的抑制白血病细胞活性的趋势。 【结论】 我们从microarray筛选获得的23种miRNA中,利用生物信息学方法确定出1种人源miRNA:miR-Ⅱ,体外实验证实miR-Ⅱ对多种白血病细胞系具有显著抑制作用,但对胰腺癌细胞系和正常细胞无明显细胞毒性。实验结果表明 miR-Ⅱ对原代白血病细胞具有一定的抑制细胞活性的趋势,具体作用机制有待进一步研究。本研究对治疗白血病miRNA的研发具有重要意义。]]> 2014/12/11 10:03:26 68true 【目的】 分析比较细胞表面不同连接方式的唾液酸在小鼠肝癌高淋巴道转移细胞株Hca-F和低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达,并研究差异性表达的α2,6-唾液酸在肝癌细胞淋巴结黏附行为中的作用及分子机制。 【方法】 利用免疫细胞化学、流式细胞技术,分析肝癌细胞表面不同连接方式的唾液酸在Hca-F和Hca-P中的表达差异;通过RNA干扰技术干预差异表达的唾液酸转移酶,并使用RT-PCR、蛋白质印迹及Lectin-blot方法检测其干扰效果;利用细胞黏附实验和凝集素阻断实验,检测干扰前后、阻断前后Hca-F细胞黏附能力的变化;利用FAK信号通路特异性抑制剂,探讨α2,6-唾液酸介导肝癌细胞黏附行为的分子机制。 【结果】 α2,6-唾液酸在小鼠肝癌高、低转移细胞株中表达具有显著差异,而α2,3-唾液酸的表达无显著差异;当通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中ST6Gal-I表达下调时,其细胞表面α2,6-唾液酸表达减少,削弱Hca-F细胞对淋巴结的黏附能力降低。此外,ST6Gal-I表达下调可抑制p-FAK及下游p-paxillin蛋白分子的表达。 【结论】 细胞表面α2,6-唾液酸可通过FAK信号转导通路正性介导肝癌细胞的黏附行为,为肝癌的治疗提供新的靶点。]]> 2014/12/11 10:03:26 67true 【实验背景】 肿瘤疫苗在近几年的飞速发展为临床的肿瘤生物治疗提供了新的思路。我们在前期研究中,偶然发现了DMSO处理Hepa1-6细胞不但能抑制细胞的增殖,而且将经过DMSO处理小鼠肝癌细胞Hepa1-6(D-hep细胞)接种于C57BL/6J小鼠皮下后,肿瘤出现先生长后消退的现象,而且在消退小鼠皮下再次接种Hepa1-6时,无肿瘤形成。这一现象提示,经过DMSO处理后的Hepa1-6细胞可以诱导小鼠建立肿瘤特异性免疫,用DMSO处理肿瘤细胞可能可以成为制备肿瘤活疫苗的新方法。国内外尚无关于该方法的相关报道。 【实验目的】 证实经DMSO处理后的Hepa1-6细胞可以诱导小鼠建立肿瘤特异性免疫,并对其相关机制作初步探讨。 【实验方法及结果】 (1)在C57小鼠和NOD/SCID小鼠皮下分别接种Hepa1-6和D-hep细胞,证实了D-hep细胞在C57小鼠皮下先成瘤再消退,而在NOD/SCID小鼠皮下肿瘤则持续生长的特性,证明D-Hep细胞成瘤特性的改变是由于小鼠免疫系统的参与导致的。(2)在肿瘤消退过程中,以及消退后再次接种Hepa1-6后的数个时间点,脾脏细胞中CD4和CD8阳性的central memory T细胞和effective memory T细胞比例有明显的上升,同时NKT细胞在早期也有明显上升,血清IFN-γ检测也显示上升曲线与流式检测结果一致。我们还观察到接种Hepa1-6后,相比于野生型C57小鼠,接种了D-hep细胞的小鼠(D-hep小鼠)Treg细胞比例上升缓慢。(3)将接种了D-hep小鼠和野生型C57小鼠脾脏细胞取出,利用CFSE标记脾脏细胞,与Hepa1-6细胞和Hepa1-6细胞裂解液共培养,发现CFSE荧光强度有多峰表现;同时,利用CCK-8法检测共培养后的肿瘤细胞活力,发现D-hep小鼠组的肿瘤细胞增殖活力明显下降。(4)对D-hep细胞和Hepa1-6细胞的表达谱芯片进行分析发现,变化数量最多,最为明显的是趋化因子和趋化因子受体一类基因,特别是其中CCL17的上升表达,提示了D-hep细胞可能通过募集和激活NKT细胞和nave CTL细胞增强了抗原提成和免疫识别能力。 【实验结论】 本研究证明了经过DMSO处理的Hepa1-6细胞具有诱导小鼠建立针对Hepa1-6细胞的肿瘤特异性免疫的能力,并阐明了在抗肿瘤免疫过程中,主要由NKT细胞和CD8阳性effective memory T细胞双重介导。本研究在国际上首次发现了基于DMSO的一种新的制备肿瘤疫苗的方法,为临床的肿瘤生物治疗提供了新的思路,具有潜在的临床治疗应用价值。]]> 2014/12/11 10:03:26 66true 【目的】 已有研究表明MAPK和PI3K信号途径是两条重要的抑制凋亡和促进增殖的转导通路,与癌症的发生发展关系密切,本实验通过检测在Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB在胃癌及癌旁组织的表达,探讨MAPK和PI3K信号通路在胃癌发展过程中的作用及意义。 【方法】 收集50对胃癌组织及其相应的癌旁组织,应用免疫组织化学技术检测胃癌及癌旁组织中Akt、Erk、Bcl-2和NF-κB蛋白的表达情况并进行分析。 【结果】 胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路是细胞内两条重要的促增殖和抗凋亡通路。PI3K-Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于中心环节,活化的Akt可激活下游信号分子,包括抑制凋亡的Bcl-2蛋白和转录因子NF-κB。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与基因表达调控,细胞功能活动以及个各种生理病理过程。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是哺乳动物中5条并行的MAPK信号通路之一,通过激活下游靶位,包括重要的转录因子NF-κB和细胞存活调节器Bcl-2,调控基因表达,从而发挥抑制凋亡的作用。本研究结果显示人胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,说明上调PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活性与胃癌的发生发展过程密切相关。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,吴志峰²,黄秀清¹;指导教师:徐丽]]> 65true 【目的】 检测血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)在原发性肝细胞癌(hepatoeellular carcinoma,HCC)中的表达与分布情况,探讨其与HCC临床病理学特征及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和增殖细胞核抗原Ki-67表达水平的关系。 【方法】 收集HCC患者病例资料保存完整的石蜡组织标本87例, 所有标本均经过病理确诊为HCC组织类型病例。采用CD34和过碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)双重染色法判定HCC标本中VM的表达、形态与分布,并分析其与HCC组织类型、Edmondson病理分级、TNM临床分期、远处转移等临床病理学特征的关系;通过免疫组织化学检测肿瘤组织中MMP-9和Ki-67的表达情况,分析HCC组织中VM分布与MMP-9及Ki-67表达的相关性。 【结果】 HCC中存在有35.63%(31/87)的病例存在VM,且出现肿瘤细胞型和细胞外基质型两种组织学类型;VM呈阳性的HCC病例更易发生远处转移(P<0.05),Edmondson 分级中Ⅰ、Ⅱ级HCC标本的VM阳性率低于Ⅲ、Ⅳ级HCC标本(P<0.05);此外,VM的阳性表达率还与肿瘤组织的MMP-9及Ki-67表达密切相关。 【结论】 HCC组织存在VM,VM的表达与HCC的组织分化程度、远处转移紧密相关,且MMP-9、Ki-67可能参与VM的形成。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,翁剑武²,郑子兵¹;指导教师:谢群]]> 64true 【目的】 探讨合并2型糖尿病(DM2)的结直肠癌患者的临床特点,了解高血糖对直结肠癌的影响。 【方法】 回顾性分析31例合并有2型糖尿病的结直肠癌患者临床病历资料(实验组)和60例结直肠癌无糖尿病患者(对照组),分析结直肠癌合并2型糖尿病患者的高血压情况、临床分期及远处转移的特点。 【结果】 无糖尿病组伴有高血压者16.7%,结直肠癌伴2型糖尿病组为29%,差异无统计学意义(P>0.05);无糖尿病组淋巴结及器官转移率为21.7%,合并2型糖尿病的结直肠癌组为46.2%,差异有显著性(P=0.02);高血糖对于结直肠癌患者的性别、TNM分期的影响无统计学差异(P>0.05)。 【结论】 伴有2型糖尿病的结直肠癌患者较单纯结直肠癌患者更易发生转移,2型糖尿病增加了结直肠癌转移的危险性。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,柯旋¹,包真¹,黄翠¹,张璋²;指导教师:范晓航]]> 63true 【目的】 观察抗癌防移片对4T1小鼠乳腺癌的影响。 【方法】 通过建立4T1乳腺癌小鼠模型,动态观察给药期间小鼠生活状况。经过小鼠体质量增加百分数、测量剥离瘤体积、计算瘤体积抑制率以及计数肺转移瘤灶个数的测定来观察抗癌防移片对4T1小鼠乳腺癌的影响。 【结果】 抗癌防移片组接种部位肿瘤体积较模型组显著缩小,乳腺癌肺转移瘤结节数较模型组也明显减少,同时与模型组比较,抗癌防移片组小鼠生活质量改善,体质量明显增加(6.58% vs 2.89%),差异均有统计学意义。 【结论】 抗癌防移片能抑制4T1小鼠乳腺癌生长与转移,改善小鼠生存质量。鉴于实验得出的数据,我们进行了分析讨论。实验结果证实了该复方既有抑制4T1小鼠乳腺癌生长与向肺部转移的作用,同时也能一定程度上增加小鼠体质量,改善小鼠生存质量,为抗癌防移片用于临床乳腺癌的治疗提供了依据。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,杨杨²,张易²,吕佳¹;指导教师:胡志希]]> 62true 【目的】 自杀基因/前体药物系统抗肿瘤作用效果显著,但自杀基因肿瘤靶向识别性差而限制其临床应用。基于叶酸偶联脂质体(FL)的生物相容性及靶向性、量子点(QD)荧光标记的高灵敏性及光稳定性、HSV-tk自杀基因独特的旁观者效应,本研究拟开发多功能纳米载体-叶酸靶向量子点标记的HSV-TK基因脂质体(FL/QD-TK),并检测此载体系统在肝癌诊治一体化中作用。 【方法】 构筑FL/QD-TK并进行表征后,利用MTT法、激光共聚焦荧光显微镜、活体荧光成像仪及裸鼠移植瘤模型等方法对其体内外靶向性成像和治疗肝癌的作用及生物安全性进行研究。 【结果】 多功能纳米载体FL/QD-TK合成方法稳定,形貌均一,对叶酸受体高表达的Bel-7402肝癌细胞表现出较强的选择性杀伤作用,而对叶酸受体低表达的HepG2细胞靶向杀伤作用较弱。FL/QD-TK可实时示踪TK基因在Bel-7402荷瘤裸鼠体内的运输与分布,实现了在肿瘤部位的靶向富集,系统性给药并联合GCV取得了良好的抗肿瘤效果,同时对各脏器组织形态学和血清学指标无影响。 【结论】 新型多功能纳米载体FL/QD-TK可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞,在体内可视化示踪TK基因治疗肿瘤并具备了较好的生物安全性,FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米药物有望应用于肝癌的诊治一体化。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,赵雪²,刘莹瑞²;指导教师:陈立]]> 61true 【目的】 凋亡与自噬密切相关,但二者之间的关系尚需进一步探究。本研究利用Bcl-2抑制剂S1建立卵巢癌细胞(SKOV3)凋亡模型,初步探究S1诱导的SKOV3细胞中凋亡对自噬的影响。 【方法】 培养SKOV3细胞。用MTT法检测S1对细胞生存率的影响。用流式细胞术检测细胞凋亡率。用蛋白质印迹方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3和自噬相关蛋白Beclin1、LC3的变化。用免疫荧光技术检测Beclin1及LC3蛋白的表达情况。在S1作用的基础上,应用广谱caspase抑制剂Z-VAD抑制caspase后,检测SKOV3细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3的变化。 【结果】 S1能够降低SKOV3细胞的生存率;增加SKOV3细胞的凋亡率。与对照组(0 h)相比,S1组(2、4、8、12、24、48 h)中的Bcl-2蛋白表达持续降低,Bax及caspase3蛋白表达持续增高,呈现出明显的时间依赖性;S1组(2、4、8、12、24、48 h)中自噬的发生也呈时间依赖性,但自噬并不是持续增强的,在12 h时,自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白表达水平最高,12 h后则呈下降趋势,Beclin1和LC3的荧光结果也表现出一致的现象。与S1单独作用(8、24 h)相比较,给予广谱caspase抑制剂Z-VAD,8 h结果显示 Beclin1及LC3蛋白的表达水平基本无变化,而24 h结果显示Beclin1及LC3蛋白的表达水平显著增高,同时荧光实验也显示出同样的结果。 【结论】 在SKOV3细胞中,S1通过抑制Bcl-2、促进Bax释放,诱导细胞发生凋亡,并呈时间依赖性增强。同时S1通过抑制Bcl-2,释放自噬起始基因Beclin1,诱导自噬发生。但是自噬并未始终呈时间依赖性增强,自噬水平在S1长时间作用下反而出现下降的趋势。据此推测,随着S1诱导凋亡的不断增强,大量活化的caspase可能通过裂解自噬起始基因Beclin1,从而抑制Beclin1诱导的自噬。]]> 2014/12/11 10:03:26 60true 【目的】 对野生型人IL-29受体结合区域的氨基酸残基进行定点改造,以期获得抗肿瘤活性更高的IL-29变异体。 【方法】 采用SWISS-MODEL网络服务器对IL-29与IL-28进行同源建模,再用Z-dock软件对IL-29与其受体结合亚基(IL-28R1)进行刚性蛋白质-蛋白质对接,然后用RosttaDOCK软件对获得的IL-29-受体复合物结构模型进行精细对接及优化。用PyMol软件分析确定IL-29肽链中与受体结合部位的关键氨基酸位点,然后以不同氨基酸进行置换和分子对接分析,用MM-PBSA法计算各位点氨基酸置换前后的结合自由能差(ΔΔG),选择ΔΔG差值大的氨基酸种类和位点为改造位点。设计定点突变引物,采用大引物PCR方法,将拟改变的氨基酸的编码碱基通过PCR扩增引入野生型IL-29基因进行置换,然后将获得的IL-29变异体基因插入质粒pPIC9K构建重组表达质粒,经测序鉴定后转化毕赤酵母进行发酵表达,发酵液经超滤浓缩和除盐后,采用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析纯化表达产物,用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析鉴定表达产物。将重组野生型IL-29、重组IL-29变异体设置高(1 000 ng/mL)、中(500 ng/mL)、低(50 ng/mL) 三个剂量组,分别对胃癌细胞SGC 7901、结肠癌细胞 HCT-8进行培养,同时设置空白对照和阴性对照组,以重组人IFN_α2b药品为阳性对照组。用WST-8法检测各组样品对肿瘤细胞增殖的抑制率,统计分析各组样品对肿瘤细胞抑制效应的差异。 【结果】 经定点改造和重组表达及纯化,获得2个变异体IL-29 L (33Lys→33Arg单点突变体)和IL-29 Z (33Lys→33Arg、35Arg→35Lys双点突变体);WST-8法预试验结果显示,与阴性对照组比较,重组野生型IL-29高剂量组对胃癌细胞SGC 7901、结肠癌细胞 HCT-8的增殖抑制率分别为15.76% (P<0.05)、10.70% (P<0.05);重组变异体IL-29 Z高剂量组对SGC 7901的抑制率为52.17 (P<0.01),对HCT-8无明显抑制效应;重组IL-29 L 高剂量组对SGC 7901、HCT-8的抑制率分别为12.74% (P<0.05)、11.80% (P<0.05)。 【结论】 通过定点突变方法对人IL-29进行定点改造,可望获得抗肿瘤活性更高的IL-29变异体。]]> 2014/12/11 10:03:26 1,朱荣²,陈莉莉¹,葛春蕾²,储晓丽¹,马旭¹,彭斐¹;指导教师:陈伟, 邬敏辰]]> 59true 【目的】 结直肠癌占全国肿瘤死亡人数的第5位。奥沙利铂是治疗晚期结直肠癌的一线药物,但它有神经毒性,会诱发神经病理性疼痛,常常被迫终止化疗。因此,研究开发毒副作用小的中草药来预防和减缓结直肠癌的生长具有重要的意义。苦参常用于治疗消化道炎症,并且国内有苦参和奥沙利铂联合用药治疗结直肠癌的报道。但是还未见苦参对体内结直肠肿瘤生长影响的研究,其作用机理也不清楚。本研究利用氧化偶氮甲烷(AOM)联合葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结直肠肿瘤模型,探索中草药苦参对结直肠肿瘤发生的影响。 【方法】 0 周龄雌性C57Bl/6J 小鼠分为3组,即I组:苦参组;II组:奥沙利铂组;III组:对照组。每组10只。腹腔注射AOM(12 mg/kg),记为第1天,正常饮水5 d后,小鼠自由饮用含 2% DSS 的去离子水5 d,继而饮用正常水 10 d,这种方式再重复2 次,但在后2次DSS浓度改为3%,诱导结直肠肿瘤。苦参碾碎后按 100 g:1000 mL去离子水混匀,煮沸30 min。冷却后,减压蒸馏浓缩到生药1 g/mL。按每天每千克小鼠10 g生药量灌胃给药。苦参组自第31天起,每天灌胃苦参液1次;奥沙利铂组在第70天起按每次6 mg/kg腹腔注射奥沙利铂,每4 d注射一次。至第100天时处死所有小鼠,分离结直肠统计肿瘤数量,并进行相关机理研究。 【结果】 苦参组结直肠肿瘤总数为18.0±1.85,与对照组(24.63±1.73)差异显著(P<0.05);其中大肿瘤(直径> 3 mm)数为0,与对照组(3.75±0.90)相比差异极显著(P<0.01);大肿瘤发生率为0,与对照组90%相比,差异极显著(P<0.01)。奥沙利铂组肿瘤总数为14.4±2.31,与对照组(24.63±1.73)相比差异极显著(P<0.01);其中中等大小肿瘤(3 mm>直径>1 mm)数为8.2±1.33,与对照组(14.63±1.29)相比差异极显著(P<0.01)。 【结论】 苦参能抑制DSS诱导的小鼠结直肠肿瘤的生长,其效果与奥沙利铂接近。特别应该注意的是,苦参能完全抑制结直肠中大肿瘤的发生。苦参的这种作用机理及有效的化学成分还不清楚,我们正在进一步研究中。结果对人结直肠肿瘤的防治及中草药的开发利用具有重要意义]]> 2014/12/11 10:03:26 58true 【目的】 结直肠癌占全国肿瘤发病人数的第三位。一些研究表明,白花蛇舌草对结直肠癌细胞系具有抑制作用,并能够防治小鼠溃疡性结肠炎。但还未见有关白花蛇舌草对体内结直肠肿瘤作用的研究报道。本研究利用氧化偶氮甲烷(AOM)联合葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结直肠肿瘤模型,研究中草药白花蛇舌草和半枝莲对小鼠结直肠瘤发生的影响。 【方法】 10 周龄雌性C57Bl/6J 小鼠分为4组,即I组:白花蛇舌草组;II组:半枝莲组;III组:白花蛇舌草和半枝莲联合组;IV组:对照组。每组10只。腹腔注射AOM(12 mg/kg),记为第1天,正常饮水5 d后,小鼠自由饮用含 2% DSS 的去离子水5 d,继而饮用正常水 10 d,这种方式再重复2 次,但是在后2次DSS浓度改为3%,以诱导结直肠肿瘤。白花蛇舌草,半枝莲碾碎后按 100 g:1000 mL去离子水混匀,煮沸30 min。冷却后,减压蒸馏浓缩到生药1 g/mL。自第31天起,按每天每千克小鼠10 g生药量灌胃给药,每天1次,至第100天时处死小鼠,分离结直肠统计肿瘤数量,并进行相关机理研究。 【结果】 白花蛇舌草组结直肠肿瘤总数为16.22±1.88,与对照组(23.55±1.86)差异显著(P<0.05)。其中大肿瘤(直径>3 mm)和小肿瘤(直径<1 mm)数分别为0.78±0.36和3.78±0.36,与对照组(3.33±0.90和6.33±0.81)相比差异均显著(P<0.05)。半枝莲组肿瘤总数为21.0±1.57,与对照组差异不显著,但其大肿瘤数与对照组差异显著(0.70±0.42 vs 3.33±0.90,P<0.05)。白花蛇舌草和半枝莲联合组肿瘤总数为16.0±1.71,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。其中中等大小肿瘤(3 mm>直径>1 mm)数为8.33±1.29,与对照组(13.89±1.36)相比差异极显著(P<0.01)。但是,与白花蛇舌草组相比,肿瘤总数及不同大小的肿瘤数差异均不显著。 【结论】 白花蛇舌草能抑制DSS诱导的小鼠结直肠肿瘤的发展,半枝莲与白花蛇舌草对小鼠结直肠肿瘤的发展没有协同抑制效果。白花蛇舌草对结直肠肿瘤的抑制作用的机理及有效化学成分还不清楚,我们正在进一步研究之中。研究结果对人结直肠肿瘤的防治具有重要理论和临床指导意义。]]> 2014/12/11 10:03:27 57true 【目的】 通过体外实验证实细胞外组蛋白(EHs)诱导肿瘤细胞死亡的现象,并探明EHs诱导肿瘤细胞死亡的死亡方式。 【方法】 (1)用EHs以不同时间和浓度梯度刺激前列腺癌骨转移细胞系(PC-3)、肺癌细胞系(A549)和肝癌细胞系(HepG2),利用MTT染色测量肿瘤细胞存活率,得到EHs诱导肿瘤细胞死亡的时间和剂量关系,并验证EHs对肿瘤细胞杀伤作用的普遍性。(2) 选择杀伤作用具有代表性的某几种肿瘤细胞,进行探明EHs诱导肿瘤细胞死亡方式的实验。我们计划向实验体系中引入各种细胞死亡方式的抑制剂:如细胞凋亡抑制剂——Z-VAD-fmk,程序性坏死抑制剂——Necrostatin-1,细胞自噬抑制剂——Chloroquine。即添加针对某种细胞死亡方式的抑制剂对肿瘤细胞进行保护,在同等条件下检测其与未添加抑制剂的肿瘤细胞的存活率的差异。若添加抑制剂后肿瘤细胞存活率升高,表明EHs诱导肿瘤细胞死亡与该方式有关。再通过与EHs刺激肿瘤细胞后的总存活率进行比较,明确该种死亡方式所占比率。(3) 确定细胞死亡方式后,对该方式进行深入探究。例如当验证为细胞以凋亡方式死亡时,则分别用caspase 8(死亡受体通路)抑制剂Z-IETD-FMK和caspase 9(线粒体介导通路)抑制剂证明EHs诱导肿瘤细胞凋亡的具体途径。 【结果】 (1) 体外实验证实EHs诱导肿瘤细胞死亡,并呈现剂量和时间依赖性(已完成);(2) 明确EHs诱导肿瘤细胞死亡的方式及其比率(部分完成);(3) 明确主要死亡方式的具体途径。 【结论】 EHs通过死亡受体和线粒体双途径诱导肿瘤细胞凋亡。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,梁东生²;指导教师:李煜生]]> 56true 【目的】 研究转移性肿瘤抗原1 (MTA1)在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌发生发展的影响;明确Epstein-Barr病毒编码的潜伏膜蛋白2A (LMP2A)和MTA1的关系及其机制。 【方法】 利用免疫组化检测鼻咽癌和正常鼻黏膜组织中的MTA1蛋白和EMT相关蛋白的表达情况,并结合临床病理特征和EMT相关蛋白进行相关性分析。构建MTA1过表达和干扰表达的鼻咽癌细胞系,蛋白质印迹和transwell实验检测MTA1对鼻咽癌细胞侵袭和EMT发生的影响。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测Wnt通路和β-catenin核转位研究MTA1发挥功能的机制。以免疫组化检测鼻咽癌组织中LMP2A和MTA1的相关性,慢病毒技术构建LMP2A表达而MTA1缺失的细胞系,蛋白质印迹和transwell实验检测其侵袭能力和EMT的变化。进而建立裸鼠尾静脉注射和左心室注射模型,体内实验研究MTA1对鼻咽癌转移的影响。使用mTOR下游调控通路4EBP1的抑制剂INK-128和siRNA干扰c-myc表达,研究LMP2A激活MTA1表达的通路机制。 【结果】 免疫组化分析发现MTA1高表达与鼻咽癌TNM分期的N和M分期呈正相关。在鼻咽癌组织中MTA1高表达于癌巢和癌浸润发生部位。MTA1的高表达与E-cadherin表达呈负相关,和Vimentin的表达呈正相关。低表达MTA1的细胞系CNE-1过表达MTA1后,侵袭能力增强,EMT表型增加。高表达MTA1的细胞系CNE-2干扰其表达后,侵袭能力减弱,EMT表型减少。裸鼠左心室注射,CNE-1-MTA1细胞转移能力增强,CNE-2-siMTA1细胞转移能力下降。CNE-1的MTA1过表达促进了Wnt1的表达,促使β-catenin的入核。LMP2A和MTA1的过表达具有正相关性。LMP2A促进了CNE-1和CNE-2细胞系表达MTA1。在LMP2A表达的细胞系中,干扰MTA1的表达能抑制肿瘤侵袭和EMT的发生。动物模型亦显示CNE-1-LMP2A的MTA1表达干扰抑制了肿瘤转移的发生。过表达LMP2A的CNE-1细胞系中mTOR和4EBP1-eIF4E axis通路活化。与Rapamycin相比较,INK-128药物能特异性抑制4EBP1-eIF4E axis的活化,降低CNE-1-LMP2A的侵袭能力、β-catenin的入核及EMT的发生。对C-myc的干扰表达,能部分降低MTA1的表达及CNE-1-LMP2A的侵袭能力。 【结论】 MTA1通过Wnt1通路活化促进了鼻咽癌的转移和EMT发生;LMP2A能激活mTOR和GSK-3β通路,4EBP1-eIF4E axis的活化参与了MTA1 mRNA的稳定性等转录后调控,也参与C-myc对MTA1的转录调控,从而增强鼻咽癌侵袭转移能力并促进EMT发生。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,严欣²,万昕¹;指导教师:陈云]]> 55true 【目的】 抑癌基因TSC1是mTOR信号通路的负调控因子,TSC1的突变或失活会引起mTOR的异常活化和不受控制的细胞生长和细胞增殖。TSC1在神经胶质瘤、胃癌、结肠癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达降低,但具体机制尚不明确。本研究旨在寻找靶向调控TSC1的miRNA,明确其对TSC1及mTOR信号通路的影响,并进一步研究该miRNA在卵巢癌中发生发展过程中的作用。 【方法】 通过生物信息学分析,初步确定候选miRNA,瞬时转染miRNA mimics和inhibitors,通过蛋白质印迹和Luciferase等方法明确靶向调控TSC1的miRNA;蛋白质印迹检测miRNA对mTOR信号通路关键分子表达的影响;建立miRNA过表达和低表达的卵巢癌细胞系,研究miRNA及TSC1对卵巢癌细胞增殖、转化、侵袭能力及化疗敏感性的影响;最后通过动物实验明确靶向调控TSC1的miRNA与卵巢癌发生发展的关系。 【结果】 瞬时转染mir-27、mir-130、mir-204的mimics并检测TSC1的表达,发现转染mir-130的细胞中TSC1表达明显降低,mTOR下游关键蛋白mTOR、p70S6K、4EBP-1的磷酸化水平升高,瞬时转染mir-130 inhibitor后,TSC1含量上调,mTOR、p70S6K、4EBP-1磷酸化水平降低,进一步佐证mir-130靶向调控TSC1,利用收集的卵巢癌及正常组织检测mir-130的表达,显示mir-130在卵巢癌中含量升高。同时我们也成功构建了稳定转染mir-130的细胞系,为后续体内体外实验奠定了基础。 【结论】 Mir-130通过靶向抑制TSC1的表达,使得TSC1/TSC2复合物含量减少,对mTOR的抑制作用减弱,从而使mTOR复合物过度磷酸化,继而磷酸化下游的靶蛋白p70S6K、4EBP-1,促进蛋白的合成,尤其是与细胞周期有关的蛋白,从而促进细胞增殖和耐药等恶性行为。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,董瑞芬²,王思奇¹,许立美³,芦山¹,李宜诺¹;指导教师:刘招舰]]> 54true 【目的】 观察褪黑素作用于肿瘤细胞后细胞的增殖改变,探讨这种增殖是否与miRNA的表达有关。 【方法】 选择适宜浓度褪黑素刺激肿瘤细胞,CCK法检测其增殖情况,流式细胞术检测处理后细胞凋亡与周期的改变。最后,通过real-time PCR和蛋白质印迹技术,从核酸和蛋白水平上进行miRNA和相关靶蛋白的检测。 【结果】 褪黑素能促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。Real-time PCR结果显示褪黑素能够明显上调NB4细胞中mir-96的表达,在BxPC3细胞中mir-34a、mir-96、mir-100均有不同程度的表达上调。蛋白质印迹结果显示BxPC3细胞中,mir-96的靶蛋白KRAS在褪黑素处理后表达下调,并具有一定浓度依赖性。 【结论】 褪黑素能够抑制BxPC3和NB4肿瘤细胞的增殖并能促进其细胞凋亡,且具有浓度依赖性和时间依赖性。这种增殖抑制可能与相关mirRNA表达改变密切相关。]]> 2014/12/11 10:03:27 53true 【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。]]> 2014/12/11 10:03:27 52true 【目的】 肺癌是最常见的恶性肿瘤,约占癌症病例的13%,死亡人数约占18%。临床上,肺癌的组织类型分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),其中NSCLC占肺癌总数的80%。肺癌细胞增殖速度快,侵袭性强,转移率高,对放疗化疗不敏感,多数NSCLC患者确诊时已出现原位侵袭和远端转移。因此寻找NSCLC早期诊断和判断预后的生物学靶标是目前肺癌研究的重要内容。高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)是分子量34 kDa的高度保守蛋白,定位于人类染色体5p13上,参与高尔基体的蛋白糖基化和加工成熟及转运过程。2009年首次指出GOLPH3是首个定位于反面高尔基网(trans-Golgi network,TGN)的癌基因,随后,2010年Clin.Can.Res.确认GOLPH3是一个具有强大转化能力的癌基因,在调控细胞增殖、分化过程中发挥重要作用。虽然许多试验已证实GOLPH3与多种癌症相关,但其在NSCLC发生发展过程中的重要作用尚未见报道。 【方法】 应用实时定量PCR (RT-PCR)和蛋白质印迹法检测在人正常肺细胞、肺癌细胞系和四对相匹配的肺癌组织及癌旁组织中GOLPH3在mRNA和蛋白质水平的表达。进一步用免疫组织化学法检测临床132例NSCLC患者临床组织石蜡切片中GOLPH3的表达水平,并应用SPSS17.0软件统计分析GOLPH3的表达水平与临床预后及诊断的相关性。 【结果】 GOLPH3在NSCLC7株细胞系中高表达;GOLPH3在NSCLC临床手术切除的癌组织中高表达;免疫组织化学结果显示在132例NSCLC患者石蜡切片中有61例GOLPH3呈高表达(46.3%),统计分析表明GOLPH3的高表达与NSCLC的病理分级密切相关(P<0.001),且GOLPH3的高表达与患者的预后有统计学意义(P<0.05),多变量分析表明,GOLPH3很可能是独立的NSCLC患者的早期诊断和预后的诊断标记物。 【结论】 GOLPH3在NSCLC的细胞系、组织和石蜡包埋的切片中高表达,GOLPH3的高表达与NSCLC的临床病理分级、TNM分期和病人预后密切相关。我们的工作表明GOLPH3很有可能成为NSCLC新的早期诊断和预后的生物学标志物。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,徐馨宇²,梁瑾³,刘星圻⁴;指导教师:巩丽云]]> 51true 【目的】 Caveolin-1(CAV1)是一种细胞膜上的支架蛋白,参与肿瘤细胞的增殖,侵袭及转移等多种生物学行为,具有抑制肿瘤形成的功能。虽然在多种癌症中均报道了CAV1基因启动子的异常甲基化,但在食道癌中至今尚无相关报道。本项目的目标是通过检测人食道组织中CAV1基因启动子甲基化水平,探讨其与人类食道癌发生、进展的相关性及其临床病理学意义。 【方法】 使用TaqMan法实时定量甲基化特异性PCR检测260例人类食道组织样本中的CAV1启动子甲基化水平。同时利用TaqMan法实时定量甲基化特异性PCR及RT-PCR分别检测OE33食道癌细胞在经过5-aza-2'dC脱甲基处理前后的CAV1的甲基化及mRNA表达水平。 【结果】 ROC曲线分析显示CAV1基因甲基化水平可以把食道腺癌及鳞癌与正常食道组织清晰区分(食道腺癌 vs 正常食道 AUROC=0.839,P<0.0001;食道鳞癌 vs 正常食道 AUROC=0.920,P<0.0001)。Barrett食管、伴有异型的Barrett食管、食道腺癌、食道鳞癌中CAV1基因甲基化水平及频度均显著高于正常食道组织(P<0.01)。同时,在41例匹配的食道正常组织和癌组织样本中,癌组织中CAV1基因的甲基化水平(均值0.273)显著高于正常组织(均值0.146,P<0.01)。在OE33食道腺癌细胞株中,用5-Aza-dC脱甲基化处理,CAV1基因的甲基化水平与其mRNA表达呈负相关。 【结论】 CAV1基因启动子甲基化在人类食道癌中普遍存在,并且在Barrett食管相关的食道腺癌的肿瘤化进程早期出现。因此,CAV1甲基化是一个新的检测食道癌的生物标记物,具有用于食道癌的早期诊断、分级、风险预测以及治疗新靶点的潜在价值。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,张媛²,黄伟玲³,简千贺⁴;指导教师:金哲]]> 50true 【目的】 研究去乙酰化修饰在瘦素(Leptin)诱导的乳腺癌细胞增殖过程中的调控作用。 【方法】 应用MTT法测定Leptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的诱导作用,并测定乳腺癌细胞活力、侵袭力及细胞周期的变化情况;实时定量PCR、蛋白质印迹法测定Leptin诱导后MDA-MB-231细胞周期关键因子及相关酶的表达情况;染色质沉淀法(ChIP)检测Leptin作用MDA-MB-231细胞后核心组蛋白H3、H4乙酰化水平变化情况。 【结果】 Leptin诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖呈现时间和剂量依赖性,1.25 nm (20 mg/mL)、24 h为Leptin最佳作用浓度和孵育时间;经Leptin处理后,乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡明显减少、活力增强,同时由G₁进入S期的细胞显著增多;荧光显微镜观察发现Leptin诱导后BrdU荧光染色增强,且主要集中在MDA-MB-231细胞核内;Transwell小室侵袭实验也显示细胞侵袭力增强;实时定量PCR及蛋白质印迹法检测 发现Leptin处理后的 MDA-MB-231细胞中与G₁/S 期限制点调控相关的细胞周期调控因子CDK2、cyclin E1以及与抑制细胞凋亡有关的Bcl-2均显著增加,细胞中HDAC酶活性增强,且与细胞周期G₁/S 期调控密切相关的HDAC1 mRNA及蛋白表达水平也明显增强;ChIP 实验发现Leptin处理后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中GAPDH 启动子区域核心组蛋白乙酰化水平显著降低,而经HDAC抑制剂SAHA阻断后MDA-MB-231细胞p21WAF 1/CIP 表达水平显著提高。 【结论】 Leptin通过HDAC1的去乙酰化修饰抑制p21WAF 1/CIP的表达,激活细胞周期关键因子CDK 2、cyclin E1的表达,从而加速乳腺癌细胞周期G₁/S 期的进程。]]> 2014/12/11 10:03:27 49true 【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,王子健¹,李一鹏²;指导教师:董凌月, 安威]]> 48true 【目的】 探讨泰山银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides,GBEP)对体外培养的食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 【方法】 通过沸水浸提,有机溶剂沉淀,并通过sevage法除去蛋白,获得GBEP。利用MTT法检测不同浓度的GBEP对食管癌细胞EC-9706增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的分布;Annexin-V/PI双染分析凋亡率;蛋白质印迹法检测与细胞周期及细胞凋亡相关的蛋白表达变化。 【结果】 GBEP显著抑制EC-9706细胞的增殖,并呈时间、剂量依赖性。其半数抑制浓度(IC50)为138.9 μg/mL。细胞周期分析结果表明,GBEP处理后G1期细胞比例由52.25%增加至69.76%,蛋白质印迹结果显示细胞周期蛋白D1的表达呈浓度依赖性下降。说明GBEP诱导EC-9706细胞G1期阻滞。流式细胞术分析结果表明,GBEP诱导的EC-9706细胞凋亡随剂量和作用时间增加而增加。同时GBEP抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达,促进caspase3的激活和PARP的剪切。 【结论】 泰山银杏外种皮多糖抑制食管癌细胞的增殖,诱导细胞G1期阻滞,并激活内源性细胞凋亡。]]> 2014/12/11 10:03:27 47true 【目的】 研究紫外线灭活复制缺陷的仙台病毒Tianjin株致人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制。 【方法】 首先制备并鉴定紫外线灭活仙台病毒Tianjin株,然后用不同剂量灭活病毒感染MDA-MB-231细胞,24 h后,MTT法检测灭活病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响;Hoechst染色及AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡情况;JC-10染色流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞线粒体膜电位变化;分光光度法测定MDA-MB-231细胞内caspase-9、-8和-3活性;蛋白质印迹法检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cyt c、caspase-9、Fas、FasL、caspase-8和caspase-3蛋白表达水平。 【结果】 MTT检测显示灭活Tianjin株能够抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性;Hoechst染色发现灭活病毒感染的MDA-MB-231细胞有明显形态学改变,细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染;AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高,JC-10染色流式细胞仪分析显示灭活病毒组细胞线粒体膜电位呈剂量依赖性降低,且与对照组比较均有统计学差异(P<0.01);caspase 活性检测显示灭活病毒组caspase-9、-8和-3活性均呈剂量依赖性升高, 与对照组比较有统计学差异(P<0.01);蛋白质印迹结果显示高剂量灭活病毒组(MOI 80)Bcl-2表达下调,Bax、Cyt C、Fas、FasL、活化caspase-9、-8和-3表达上调。 【结论】 灭活仙台病毒Tianjin株能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体内源性途径和死亡受体外源性途径密切相关。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,申天宇²,李飞³,王顺达²,李莹¹;指导教师:石立莹]]> 46true 【目的】 分析CXC趋化因子配体14(chemokine CXC ligand 14,CXCL14)在结肠癌组织中的表达及其临床意义,并探讨其过表达对结肠癌细胞增殖、细胞周期的影响。 【方法】 采用实时荧光定量PCR、免疫组化检测40例结肠癌及癌旁正常组织中(距肿瘤边缘2 cm处)CXCL14的mRNA和蛋白表达。Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归模型评估CXCL14在结肠癌组织中表达的临床意义。为分析CXCL14对结肠癌细胞的直接影响,本研究进一步构建过表达CXCL14的慢病毒,转染HT29结肠癌细胞,通过蛋白质印迹法检测转染后HT29结肠癌细胞中CXCL14的蛋白表达,利用CCK-8试剂盒、流式细胞技术检测过表达CXCL14对结肠癌细胞增殖能力的影响及细胞周期分布的改变。 【结果】 CXCL14 mRNA和蛋白水平在结肠癌组织中的表达水平较正常组织明显降低(P<0.05)。临床相关性分析表明,CXCL14表达下调与淋巴结转移及肿瘤的临床病理分期有关(P<0.05),与年龄、性别、浸润程度、肿瘤标志物等未见显著相关性(P>0.05);其中有淋巴结转移的结肠癌肿瘤组织CXCL14的相对表达量明显低于无淋巴结转移肿瘤组织(P<0.05),病理分期属Ⅲ、Ⅳ期的结肠癌肿瘤组织CXCL14的相对表达量也明显低于病理分期属Ⅰ、Ⅱ期标本(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示, CXCL14蛋白低表达的患者5年生存率显著性降低(P<0.01 )。成功构建过表达CXCL14的慢病毒,CXCL14慢病毒转染的HT29结肠癌细胞能明显上调CXCL14表达;CCK-8细胞增殖试验显示,CXCL14慢病毒转染HT29结肠癌细胞上调CXCL14表达后,细胞活力明显受到抑制 (P<0.01);细胞周期分析显示,CXCL14过表达结肠癌细胞在G0/GI期的细胞百分数显著高于对照组(P<0.05),而S期的细胞百分数显著低于对照组(P<0.05)。 【结论】 CXCL14可作为一个潜在的抑癌基因参与结肠癌的发生、发展过程,并为结肠癌的防治及预后评价提供一种新的候选靶点及临床辅助指标。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,姚一琳²,阮烨飞¹,林敏敏³;指导教师:林刻智]]> 45true 【目的】 血管生成(angiogenesis)是肿瘤生长与转移过程中的重要环节。本文采用斑马鱼胚胎血管生成模型研究甘草中黄酮类化合物的抗血管生成作用及其分子机制。 【方法】 首先在斑马鱼胚胎血管生成模型中研究4种甘草黄酮类化合物(异甘草素、光甘草定、甘草查尔酮A和甘草素)的抗血管生成作用。随后,选用上述作用较强的化合物处理人肺腺癌细胞系A549制备条件培养液,采用ELISA法检测条件培养液中重要的促血管生成因子20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)和血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量的变化,同时采用Transwell小室模型检测血管内皮细胞(HUVEC)迁移。最后,在小鼠肝癌H22和乳腺癌4T移植瘤模型中进一步验证其作用。 【结果】 在以上4种甘草黄酮类化合物中,异甘草素和光甘草定的抗斑马鱼胚胎血管生成作用相当,但明显强于甘草素和甘草查尔酮A。异甘草素可浓度(5、10和20 μmol/L)依赖性抑制内皮细胞迁移,抑制率最高可达74.8 %。异甘草素还可浓度(5~20 μmol/L)依赖性抑制A549细胞20-HETE和VEGF分泌,抑制率分别可达72.4 %和72.3 %。异甘草素25.0和50.0 mg/kg可显著抑制小鼠肝癌H22和乳腺癌4T移植瘤的生长和血管生成。 【结论】 4种甘草黄酮类化合物均对斑马鱼胚胎血管生成具有显著抑制作用,但异甘草素和光甘草定的作用明显强于甘草素和甘草查尔酮A。异甘草素可显著抑制人脐静脉内皮细胞迁移,其机理可能与抑制20-HETE和VEGF分泌有关。下一步有待采用人肝癌和乳腺癌裸鼠移植瘤模型进行研究。]]> 2014/12/11 10:03:27 44true 【目的】 肺癌是目前世界癌症导致死亡排名第一的肿瘤,其中肿瘤细胞的增殖和转移与肺癌的死亡率密切相关。最近的调查显示肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与肿瘤的侵袭和转移相关,但是具体的机制仍不清楚。本实验旨在以肺癌A549细胞作为模型,研究TNF-α/HIF-1α/VASP途径在肺癌A549细胞的增殖和粘附中的作用。 【方法】 常规培养A549细胞,用MTT法和adhesion assay分别检测不同浓度的TNF-α对A549细胞增殖和粘附的影响。在随后的实验中采用高浓度的TNF-α刺激(120 ng/mL)作为刺激因素,分别用sh-RNA和pEGFP-C1-VASP敲除或过表达VASP、用siRNA和pEGFP-C1敲除或过表达HIF-1α,MTT法和adhesion assay分别检测细胞增殖和粘附水平,PCR检测HIF-1α和VASP在mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测HIF-1α和VASP蛋白的表达。同时采用Luciferase assay 的方法检测HIF-1α与VASP启动子区域结合的状态。 【结果】 (1)高剂量TNF-α可以促进HIF-1α表达,从而下调VASP表达水平,抑制肺癌A549细胞增殖和粘附。(2)与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染VASP过表达质粒pEGFP-C1-VASP后,A549细胞的增殖能力显著增加(P<0.05),粘附能力显著增加(P<0.05)。相反,与Scrambled-shRNA组比较,通过转染VASP shRNA特异性敲降VASP后,A549细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),粘附能力显著降低(P<0.05)。(3)选择高浓度TNF-α(120 ng/mL)处理A549细胞24小时后,与空载质粒pEGFP-C1组相比,瞬时转染HIF-1α过表达质粒pEGFP-C1-HIF后,HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著增加(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著降低(P<0.05)。相反,与Scrambled-siRNA组比较,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α后, HIF-1α的表达在mRNA 和蛋白水平都显著降低(P<0.05),与此同时VASP的表达在mRNA和蛋白的水平显著增高(P<0.05)。(4)在给予肿瘤坏死因子-α诱导的细胞中,通过转染HIF siRNA特异性敲降HIF-1α表达后,TNF-α带来的HIF-1α的升高被部分抵消了(P<0.05)。(5)Luciferase assay 的检测结果提示HIF-1α可以与VASP启动子区域结合从而在转录水平上抑制VASP的表达。 【结论】 高浓度TNF-α通过增加HIF-1α的表达,调控并抑制VASP蛋白的表达,从而降低肺癌A549细胞增殖和粘附,从而发挥抗肿瘤的作用。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,李群¹,喻译锋²,罗振宇²,孙孔亮²;指导教师:魏蕾]]> 43true 【目的】 顺铂和依托泊苷联合化疗(EP)是临床常用的针对肺癌的化疗方案。但长期应用EP后,其药效减弱,产生多药耐药,影响疗效。并有文献报道,某些促炎因子在多药耐药中发挥着作用。本课题旨在探究EP诱导的化疗耐药机制,找出潜在的多药耐药作用靶点。 【方法】 (1)基础实验:选用NCI-H446和A549肺癌细胞系,DDP处理后进行细胞克隆形成实验,发现在CM培养条件下,两种细胞耐药性形成。以此为基础进行设计。用TNF-α、EP、CM、TNF-α抑制剂分别或共同处理H446和A549细胞,通过光镜、流式细胞术、台盼蓝细胞计数来明确细胞存活情况。用TNF-α处理后通过蛋白质印迹和real-time PCR法检测ABCG2、MRP2、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达,再用TNF-α siRNA进行干扰,用real-time PCR检测。先用蛋白质印迹法检测两种细胞中磷酸化ATM和磷酸化IkB-a的表达情况,再用TNF-α处理,通过蛋白质印迹和共聚焦显微检测,确定磷酸化ATM、磷酸化p65和磷酸化IkB-a的表达。用TNF-α、ATM抑制剂、NF-κB抑制剂分别和(或)共同处理细胞,通过蛋白质印迹和confocal来确定磷酸化ATM、磷酸化p65、磷酸化IkB-a、ABCG2、MRP2、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达。通过siRNA干扰ATM、p65,再用蛋白质印迹和real-time PCR来确定这些蛋白的表达。(2)临床实验:通过回顾性分析,取小细胞肺癌和非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织,通过免疫组化检测TNF-α的表达情况。再结合患者的预后,进行数据分析,探究患者TNF-α表达和预后之间的关系。 【结果】 DDP处理的细胞克隆实验发现,在CM培养条件下,NCI-H446和A549两种细胞耐药性比DDP组明显,说明两种细胞耐药性形成。 【结论】 CM中含有的某一细胞因子(TNF-α)能够诱导NCI-H446和A549两种肺癌细胞耐药性形成,为治疗肺癌多药耐药提供新的可能的治疗靶点。]]> 2014/12/11 10:03:27 42true 【目的】 肝癌是目前我国发病率和致死率位居第二位的恶性肿瘤,每年约有30万例新发肝癌,占全球50%以上。尽管通过手术和化学药物治疗,其五年生存率仍然很低,肝癌细胞对于化疗药物的耐药性的产生是肝癌高致死率的主要原因。 Polycomb group(PcG)蛋白通过染色质的组蛋白甲基化修饰调控靶基因的转录,是重要的促癌基因。我们及其他研究组发现,在肝细胞肝癌中PcG家族蛋白异常高表达,与肝癌术后存活率等恶性指标密切相关,是肝细胞肝癌预后的重要分子标志物。然而,PcG蛋白在肝癌细胞耐药性的产生中如何发挥作用尚不清楚。本研究主要探讨PcG家族蛋白调控肝癌细胞化疗耐受性产生的生物学功能及其靶基因网络,并阐明其表观遗传学机制。 【方法】 用表柔比星、丝裂霉素C等化疗药物短期处理HepG2等肝癌细胞系,real-time qRT-PCR、蛋白质印迹检测EZH2、SUZ12、CBX8及BMI1等PcG家族蛋白表达规律;通过建立EZH2过表达或shRNA干扰稳定细胞系,克隆形成和流式细胞技术等技术检测细胞增殖、细胞凋亡等指标,探讨EZH2异常表达肝癌细胞对化疗药物的敏感性;从实验室前期ChIP-on-ChIP组学数据的整合性分析入手,筛选ATM等靶基因,探讨PcG调控ATM转录及表达的规律及机制;深入揭示ATM通路在PcG调控的肝癌细胞化疗药物耐受性产生中的关键作用。 【结果】 通过前期实验我们发现:短期化疗药物处理导致PcG蛋白表达量下降,而不影响其转录水平表达,提示化疗药物通过蛋白稳定性影响PcG蛋白表达;PcG通过H3K27me3组蛋白甲基化机制抑制DNA损伤修复基因ATM表达,参与化疗药物引起的肝癌细胞DNA损伤修复过程,从而引起化疗药物耐受性产生;EZH2蛋白的SET酶活性为靶点的小分子化合物GSK126显著促进肝癌细胞化疗药物敏感性。 【结论】 PcG蛋白通过表观遗传学机制调控的ATM通路是肝癌细胞化疗耐受性产生的关键通路之一,以PcG-ATM为靶点的小分子化合物是有希望的化疗增敏剂。]]> 2014/12/11 10:03:27 41true 【目的】 观察乳浆大戟提取物对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901和肺癌细胞A549增殖的影响及其可能的作用机制。 【方法】 不同浓度的乳浆大戟提取物作用于体外培养的人胃癌细胞SGC-7901和肺癌细胞A549,采用MTT法观察乳浆大戟提取物对SGC-7901和A549细胞增殖的影响;PI染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测SGC-7901和A549细胞的凋亡率。 【结果】 乳浆大戟提取物抑制SGC-7901和A549细胞的增殖,具有时间、剂量-效应关系,最大抑制率分别为34.8%和46.3%;流式细胞仪结果显示,乳浆大戟提取物可以诱导SGC-7901和A549细胞凋亡,最大凋亡率分别是28.5%、48.4%。 【结论】 乳浆大戟提取物通过诱导SGC-7901和A549细胞凋亡而抑制细胞增殖。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,向云涛¹,程建辉¹,张向红²,马繁荣²;指导教师:王爱红]]> 40true 【目的】 探讨中药珍珠梅黄酮纳米粒(TTF1-NP)对人肝癌HepG-2细胞的内质网应激作用机制。 【方法】 通过MTT法观察不同时间(24、48、72h)、不同浓度(50、100、200 μmol/L)的TTF1-NP对人肝癌HepG-2细胞及正常肝细胞的增殖抑制影响;通过H-E、Hoechst和AO/EB染色观察TTF1-NP诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的形态学变化,利用流式细胞凋亡技术检测人肝癌HepG-2细胞的凋亡情况,蛋白质印迹和免疫细胞化学染色技术检测TTF1-NP诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的内质网应激起始蛋白GRP78及内质网应激凋亡蛋白CHOP、JNK及caspase-4的表达情况。 【结果】 MTT法检测细胞增殖抑制结果显示:不同浓度的TTF1-NP抑制人肝癌HepG-2的生长,呈一定的浓度和时间依赖关系。形态学检测结果:TTF1-NP作用后细胞数减少,形态改变,细胞变圆,变小,细胞核固缩,碎裂,细胞深染(H-E染色);随着TTF1-NP浓度增加,细胞染为红色(AO/EB染色);随着TTF1-NP浓度增加,细胞减少,细胞核内可见颗粒块状蓝色荧光(Hoechst染色)。流式凋亡检测结果:对照组细胞凋亡率为4.9%;50、100、200 μmol/L的 TTF1-NP作用人肝癌HepG-2细胞后,凋亡率为凋亡率为20.1%、86.2%、93.8%。蛋白质印迹检测结果显示,对照组细胞内CHOP、GRP78、JNK及caspase-4表达量很低,随着TTF1-NP浓度增加,上述蛋白表达逐渐升高,免疫细胞化学染色检测结果与蛋白质印迹检测结果基本相同。 【结论】 TTF1-NP可以诱导人肝癌HepG-2细胞,内质网应激途径是其诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的作用机制之一。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,李毓²,吴晓琴¹,肖斌³;指导教师:张学武]]> 39true 【目的】 采用间断给药二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型,动态观察肝细胞癌变过程中内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)信号通路关键调控因子的变化,为阐明肝癌的发生机制、预防和靶向治疗提供实验依据。 【方法】 清洁级雄性Wistar大鼠136只,5周龄,体质量140~160 g,分为:(1)实验组120只:用灭菌食用水配置浓度0.01%DEN溶液,连续饮用5周后,改饮一般的灭菌食用水3周,再继续饮用含0.01%的DEN溶液12周停药;(2)对照组16只:整个过程均饮用灭菌食用水,实验组大鼠分别在5、8、10、12、14、16、18、20周各处死15只,正常组于5~20周之间以上各时间点处死2只对照组大鼠。利用光镜和电镜技术观察诱癌过程中肝组织的形态学变化,采用蛋白质印迹和real-time PCR技术检测GRP78、PERK、ATF6、IRE-1、CHOP、eIF2α、TRAF2和 caspase12表达情况。 【结果】 实验组大鼠诱癌早期(1~8周):肝小叶结构基本完整,部分肝细胞呈气球样变,可见灶性坏死伴炎性细胞浸润,逐渐出现纤维组织增生及肝细胞再生,线粒体肿胀,基质颗粒消失和空泡变;诱癌中期(9~14周):肝脏表面出现灰白色病灶,形成典型的假小叶结构,线粒体数目增多、嵴断裂;诱癌晚期(15~20周):癌细胞异型性明显,出现单核细胞和核分裂相,线粒体减少、结构不清,粗面内质网失去层状结构,核蛋白体脱落。蛋白质印迹和real-time PCR结果显示:ERS相关蛋白在诱癌早、中期(1~14周),这些蛋白逐渐升高,诱癌晚期(15~20周)表达达到峰值后无明显变化。 【结论】 ERS参与了DEN诱发大鼠肝损伤、肝细胞增生、肝硬化的发生过程,但是大鼠形成肝癌后,ERS不参与肝癌细胞的生长。]]> 2014/12/11 10:03:27 1,玄皗彗²,张芷荧³,肖斌⁴;指导教师:张学武]]> 38true 【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。]]> 2014/12/11 10:03:27 37true 【目的】 研究介导乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)药物抵抗的新机制。 【方法】 通过CCK-8 assay和球囊形成实验检测MCF-7细胞和(或)无血清非粘附悬浮培养得到富集BCSCs 的MCF-7 mammosphere(MCF-7 MS)对紫杉醇和盐霉素反应的差异。通过蛋白质印迹、免疫荧光或免疫组化检测MCF-7和MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中Hedgehog(Hh)通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,及紫杉醇或盐霉素处理后表达的改变。进一步应用CCK-8 assay和球囊形成实验考察Hh通路主要配体Shh或SMO抑制剂环巴明对盐霉素或紫杉醇抑制MCF-7 MS细胞增殖作用的影响。此外,动物水平也考察了MCF-7 MS细胞移植瘤内Hh通路活性与荷瘤鼠药物敏感性的关系。而且,在290例临床乳腺癌病理组织中,以免疫组化检测及卡方检验分析了SMO及Gli1的阳性表达与BCSCs特异标记物CD44⁺/CD24-表达的相关性。 【结果】 MCF-7 MS具有BCSCs的CD44⁺/CD24^-/low表型、高表达干细胞标记物OCT4、强的克隆形成能力、强的侵袭迁移能力、强的在体成瘤能力等干细胞特性。MCF-7 MS对紫杉醇不敏感,而对盐霉素高度敏感,不同于MCF-7细胞对紫杉醇敏感,而对盐霉素不敏感。MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中的Hh通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达均明显高于MCF-7细胞。盐霉素可明显抑制MCF-7 MS细胞中Hh通路这些因子的表达,而紫杉醇未见抑制作用,且盐霉素和紫杉醇均对MCF-7细胞中的这些蛋白的表达无抑制作用。进一步发现了Shh激活或环巴明抑制Hh通路分别下调或上调了MCF-7 MS对盐霉素或紫杉醇的敏感性。而且,在荷瘤鼠水平也发现了可抑制MCF-7 MS荷瘤鼠移植瘤生长的盐霉素也抑制了PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,而对荷瘤鼠移植瘤生长无明显抑制作用的紫杉醇对这些因子的表达也无明显的抑制作用。此外,在临床乳腺癌病理组织中,发现了SMO及Gli1的阳性表达与CD44⁺/CD24^-表达正相关。 【结论】 在细胞、裸鼠移植瘤水平及临床病理组织中,乳腺癌干细胞介导的药物敏感性与Hh通路活性改变相关。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,高雅²,聂昕时¹,孙子懿³,李英研⁴,周晓丹⁴,田冰⁴;指导教师:魏敏杰, 何苗]]> 36true 【目的】 在首次检测肺腺癌A549细胞各促代谢型谷氨酸受体表达谱的基础上进一步观察高表达的促代谢型谷氨酸受体对肺腺癌A549细胞增殖的影响,为深入揭示肺癌的发生发展机制的研究提供新的线索。 【方法】 传代培养A549细胞24 h至亚融合且生长状态良好,采用real-time PCR技术检测A549细胞8种促代谢型谷氨酸受体(mGluR1、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR5、mGluR6、mGluR7、mGluR8)mRNA表达情况;明确各高表达促代谢型谷氨酸受体亚型,并使用相应促代谢型谷氨酸受体激动剂培养48 h,CCK8试剂盒检测A549细胞增殖的差异。 【结果】 (1)A549细胞各促代谢型谷氨酸受体mRNA表达谱:II组促代谢型受体mGluR2和mGluR3无表达,I组促代谢型受体mGluR1和mGluR5低水平表达,III组促代谢型受体mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8均有表达,其中以mGluR8表达水平最高, mGluR4次之,mGluR7弱表达。(2)mGluR8激动剂DCPG在0.01~10 μmol/L范围内对A549细胞的增殖有剂量依赖性抑制作用(P<0.01),mGluR4激动剂VU0155041在0.01~10 μmol/L范围内对A549细胞的增殖作用与不加激动剂的对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 【结论】 A549细胞表达6种促代谢型谷氨酸受体,其中以mGluR8表达水平最高;mGluR8的激活具有抑制A549细胞增殖的作用。]]> 2014/12/11 10:03:28 35true 【目的】 色素上皮细胞衍生因子(PEDF)是一种多功能分泌性糖蛋白,具有神经营养、抑制新生血管和抗肿瘤的作用。PEDF通过降低微血管密度从而抑制肿瘤的作用已有研究,但其在乳腺癌转移中的确切作用和机制尚不明了。 【方法】 体内实验中,我们使用稳定表达PEDF的MDA-MB-231乳腺癌细胞原位肿瘤模型评估裸鼠乳腺癌的肝转移和肺转移。体外实验中,在MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞过表达PEDF,用Boyden小室检测其的侵袭和转移能力。此外,PEDF对乳腺癌细胞EMT相关的Maker、纤连蛋白(fibronectin)及p-AKT、p-ERK分别用qRT-PCR、蛋白质印迹法和荧光免疫细胞化学法测定。肿瘤血管新生密度用MVD分析。 【结果】 实验发现,体外实验和在体实验中,PEDF均明显抑制了乳腺癌的转移。PEDF抑制肿瘤转移是通过抑制fibronectin表达,而非逆转EMT途径,而增加fibronectin可抵消PEDF的抑制乳腺癌的作用。此外,PEDF抑制fibronectin蛋白的表达是通过层黏连蛋白受体(laminin receptor)及后续的p-ERK 和p-AKT信号通路起作用的。 【结论】 实验结果证实了PEDF在乳腺癌生长和转移中发挥重要作用,并且发现,PEDF是通过层黏连蛋白受体介导和抑制fibronectin表达得以实现的。这为今后的乳腺癌治疗提供了新的思路。]]> 2014/12/11 10:03:28 34true 【目的】 槲皮素具有一定的抗肿瘤活性并且毒性较低,具有良好的应用前景,但因溶解性差,不易吸收,影响了其开发和利用。本研究以槲皮素为原料,合成一系列烃基化衍生物,并考察这些衍生物对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及可能的机制。 【方法】 将槲皮素进行乙酰化保护,在乙腈中以不同试剂烃基化,产物经重结晶和柱层析法纯化,以MS、¹HNMR、¹³CNMR、NOESY进行产物分子量测定及结构表征。测定各产物在DMEM培养基中的溶解度,选取溶解度较好的产物,以MTT法测定其对MCF-7 细胞增殖率的影响,以HPLC法测定其在MCF-7细胞中浓度随时间的变化。选取IC50较小的产物,分别以AV-PI双染-流式细胞术、DAPI染色、DNA片段化分析考察其对MCF-7细胞的促凋亡作用。分别经DCFH-DA染色和JC-1染色测定衍生物对MCF-7细胞中ROS生成量及线粒体膜电位的影响,MTT法测定ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸及广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对衍生物促凋亡作用的影响,以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白在MCF-7细胞中的表达。 【结果】 对槲皮素烃基化得到了7种衍生物,其中,7-O-丁基槲皮素(BQ)和 7-O-香叶基槲皮素(GQ)在DMEM中的溶解度均大于100 μmol/L,对MCF-7细胞的IC50分别为(22.6±2.2) μmol/L、(43.5±2.1) μmol/L。BQ及GQ在MCF-7细胞中的蓄积浓度比高于槲皮素数倍,且在细胞中停留的时间更长,对MCF-7的促凋亡作用明显强于槲皮素。作用机制研究表明,BQ及GQ对MCF-7细胞的促凋亡作用是由AIF及Endonuclease G引起的caspase非依赖性凋亡导致的。 【结论】 以槲皮素为原料获得的烃基化衍生物BQ和GQ显示出较好的溶解性和对MCF-7细胞的促凋亡活性,为槲皮素衍生物的研究开发奠定了基础。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,栗境铎²,刘姿¹,孙耀庭¹;指导教师:甄宇红]]> 33true 【目的】 分别研究具有苄基和哌嗪基取代的氟康唑类似物的抗真菌活性。 【方法】 设计并合成了36个目标化合物,其结构经¹HNMR、¹³CNMR、MS等确认均正确。选择8种临床常见的真菌为实验菌株,进行体外抑菌活性测试。 【结果】 体外抑菌实验表明,所有化合物均具有一定的抗真菌活性,部分化合物活性优于氟康唑。 【结论】 两类新型氟康唑类似物均具有一定的体外抗真菌活性。]]> 2014/12/11 10:03:28 32true 【目的】 研究驱蚊植物的活性成分的驱蚊效果并试制驱蚊水; 【方法】 在福建省疾控中心养蚊实验室饲养研究所用的白纹伊蚊,用人体趋避实验和玻璃箱实验来测试驱蚊植物活性成分和市售驱蚊液对白纹伊蚊的驱避活性,市售驱蚊液强生与宝宝金水中含有合成驱蚊酯,驱蚊效果十分显著,而双飞人中无合成驱蚊酯效果较前两者不明显,在此基础上研制全天然成分驱蚊液配方并测试驱蚊活性。 【结果】 表明单组份的驱蚊植物精油的驱避率是比较高的,松油、柏木油、樟脑油、桉叶油、青蒿油的驱避率分别为78.60%、70.20%、72.67%、2.00%、34.00%,在实验室过程中玻璃箱的实验数据波动不大但与市场驱蚊水的驱避率有一定的差距,市售的宝宝金水的驱避率为91.28%,强生为90.38%,双飞人为86.47%,击倒率分别为22.72%、16.00%、35.44%,这可能与实验研究时的条件和所建立的模型不同有关,改良后的配方如:薄荷油5%樟脑油 2%、桉叶油3%、青蒿油1.5%、松油3%、无水乙醇 85.5%的趋避率分别为79.33%,击倒率为39.33%;薄荷油5%、樟脑油2%、桉叶油3%、青蒿油1.5%、香茅油3%、无水乙醇 85.5%的趋避率66.67%,击倒率为21.33%,这些配方对驱避蚊子有一定的作用。 【结论】 研究驱蚊实验中的条件不同、实验者个体间的差异,就如人体试验的数据波动比较大,这可能是实验者的血型不同、出汗量不同、体味不同、肤色亮度不同等原因影响实验结果,同时在建立模型的过程中考虑的条件不同也会使实验数据相差很大。以目前实验研究显示利用驱蚊植物精油合成的驱蚊水对蚊子有一定的趋避作用,若进行更多的研究有望超过市场现有驱蚊水,并在未来生活中占主要地位。]]> 2014/12/11 10:03:28 31true 【目的】 建立天麻药材薄层色谱指纹图谱,并对不同产地的天麻药材的指纹图谱进行比较分析,获得能体现天麻药材共性、可对其进行有效鉴别的TLC指纹特征峰,从中提取出能从整体上反映天麻药材质量的数量化特征,并采用模式识别技术对指纹特征进行解析, 实现从整体上对各种天麻药材的质量进行综合评价。 【方法】 取天麻细粉加甲醇超声后,滤过,滤液浓缩,浓缩液用硅胶拌样,挥干溶液,过硅胶柱,以洗脱剂:乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:0.2)洗脱,洗脱液蒸干,用甲醇溶解残渣,离心即得对照药材溶液和供试品溶液;采用薄层硅胶GF254板,用甲醇预展开,110℃活化30 min,取供试品溶液和对照药材溶液各10 μL,对照品溶液各5 μL,用半自动点样仪点于距薄层板底边8 mm处;以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2.5:1:1:0.1)为展开剂,以10%硫酸乙醇溶液显色后,在紫外灯(366 nm)下检视并照成像,并利用指纹图谱系统解决方案软件生成共有模式,进行聚类分析和主成分分析。 【结果】 筛选和优化了薄层色谱条件,斑点显色清晰,聚类分析和主成分分析表明,不同产地的天麻存在一定差异,同一产地的不同批次天麻也存在一定差异, 30 个不同居群样本可以划归为5 类,可能原因主要是地理距离的远近造成地理空间隔离,形成居群多样性分化,也可能由于气候环境不同,造成天麻生长环境的温度湿度不同,造成其主成分含量有所差异,为从源头保证天麻药材的质量奠定基础,为天麻药材的原料鉴定与质量控制提供依据;对照品指认结果表明:不同来源的30批天麻药材均含有天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、腺苷等4个成分,但其含量有较大差别。相对于对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等成分,天麻素的含量最高,而腺苷的含量相对最低,这提示天麻素这类化合物在天麻的药理活性中可能发挥重大作用,也为进一步地制定天麻的质量控制方法提供依据。 【结论】 建立了天麻药材薄层色谱指纹图谱,为天麻药材指纹图谱的研究奠定了方法学基础,可以作为不同来源天麻药材质量控制的重要依据。]]> 2014/12/11 10:03:28 30true 【目的】 建立血浆中原儿茶酸、山奈素-葡萄糖苷、槲皮苷和山奈素-鼠李糖苷4个指标成分的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)分析方法,采用DAS 2.0软件计算药动学参数,研究大鼠口服及静注给予荭草花提取物后的药代动力学特征。 【方法】 利用大鼠口服及静注给予荭草花提取物后,于不同时间点取血测定,血浆样品选择酸化后甲醇沉淀蛋白,UPLC-ESI-MS/MS检测。采用Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱,流速: 0.35 mL/min,流动相: 0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱,口服给药的扫描方式为选择离子监测(SIR),用于定量分析的原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷、槲皮苷、山柰素-鼠李糖苷、葛根素(内标)监测离子分别为m/z 153.0;m/z 449.3;m/z 449.2;m/z 433.2;m/z 417.2。 静脉注射给药的扫描方式为为多反应离子监测(MRM),用于定量分析的原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷、槲皮苷、山柰素-鼠李糖苷、葛根素(内标)监测离子分别为m/z 153.0→109.0;m/z 449.3→287.1;m/z 449.2→303.1;m/z 433.2→287.1;m/z 417.2→267.1。 【结果】 建立的生物样品中各指标成分的分析方法符合样品测定要求。大鼠口服荭草花提取物后,原儿茶酸等4个指标成分能够较快吸收进入体内,T_max为0.5~0.7 h,MRT_0-t为3.3~13.5 h、AUC(0-t)为105.2~1327.3 μg/(L·h)、t_1/2z为8.3~15.9 h;大鼠静注荭草花提取物后,原儿茶酸等4个指标成分在大鼠体内消除较快,MRT_0-t为43.0~60.0 min、AUC(0-t)为56.7~379.8 mg/(L·min)、t_1/2z为41.9~108.2 min;原儿茶酸、山奈素-葡萄糖苷、槲皮苷和山奈素-鼠李糖苷在大鼠体内的绝对生物利用度分别为2.5%、0.17%、0.42%、0.30%。 【结论】 建立了荭草花提取物中原儿茶酸等主要成分在生物样品中超高效液相-质谱分析方法,方法学考察结果表明所建立的方法特异、快速、准确、灵敏。实验获得了原儿茶酸等4个指标成分在大鼠体内的药动学参数及口服生物利用度,为以荭草花为原料的药物制剂和药用资源深度开发奠定了科学依据。]]> 2014/12/11 10:03:28 29true 【目的】 对药食两用的金虫草进行全面分析,选取5个不同产地的金虫草(广东、黑龙江、青海、沈阳、云南),进行形态观察、水分测定以及指纹图谱研究,并对金虫草微量元素和有效成分进行定量测定。 【方法】 金虫草形态采用粉末显微观察;水分采用快速水份测定仪测定;指纹图谱研究联合采用紫外光谱、红外光谱、液相色谱和质谱四种方法;微量元素采用原子吸收测量对人体有益的铜、锌、铁、锰四种元素;有效成分则采取三重四极杆液质联用外标法定量,主要对虫草素、腺苷和尿苷三种极具药理价值的有效成分进行分析。 【结果】 5个产地金虫草均观察到红棕色块、单个刚毛、肌纤维和菌丝体等。5个产地金虫草含水量在98.8~114.4 g/kg之间。金虫草指纹图谱研究中紫外图谱和红外图谱区分度不高,转换二阶导数光谱后区别明显,色谱和质谱采用对照品方法进行指纹图谱分析。5个产地金虫草微量元素研究中,Cu含量在14.711 3~22.807 6 mg/kg之间, Zn含量在79.378 3~120.859 1 mg/kg之间,Fe含量在22.203 9~258.214 4 mg/kg之间,Mn含量在6.117 7~13.842 0 mg/kg之间。5个产地金虫草有效成分研究中,虫草素含量在1.236 0~3.284 0 mg/g之间,腺苷含量在2.957 6~4.020 6 mg/g之间,尿苷含量在1.487 6~3.411 9 mg/g之间。 【结论】 本文结合多种分析仪器、探索不同分析条件与方法,围绕金虫草质量标准研究作创新性基础研究。研究结果表明:不同产地的金虫草,显微形态、含水量、指纹图谱、微量元素及有效成分因栽植产地和方法不同有明显差异性,这种差异性将影响其药食价值。]]> 2014/12/11 10:03:28 28true 【目的】 采用响应面分析法优选超声波法提取黄芩总黄酮的工艺条件,为工业化生产黄芩总黄酮提供理论参考;探究提取纯化后的黄芩总黄酮对Hela细胞增殖的影响,为宫颈癌的治疗提供新的应用依据。 【方法】 采用超声波法提取黄芩总黄酮,对使用Al(NO₃)₃-NaNO₂显色法测定黄芩总黄酮进行方法学考察;选取乙醇浓度、液固比、提取时间3个影响因素进行Box-Benhnken中心组合设计,利用响应面分析法(RSM)对提取工艺参数进行优化;利用优选条件提取黄芩总黄酮后采用大孔吸附树脂法对其进行纯化,用CCK-8法检测所得产物对Hela细胞的生长抑制作用。 【结果】 方法学考察结果表明本实验室采用Al(NO₃)₃-NaNO₂显色法测定黄芩总黄酮及超声提取工艺可靠;提取黄芩总黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度60%,液固比40 mL/g,提取时间45 min;预测值为1.776%,实际得率为1.704%,两者吻合度较高。50~800 μg/mL各组黄芩总黄酮在72 h内均抑制Hela细胞生长,呈时间和剂量依赖性,CCK-8检测结果显示48 h黄芩总黄酮的IC50为323.79 μg/mL。 【结论】 Box-Benhnken设计结合响应面分析法对黄芩总黄酮提取工艺进行优化方便、快捷,得出的参数可信度高、实用性好;纯化后的黄芩总黄酮能显著抑制Hela细胞的生长。]]> 2014/12/11 10:03:28 27true 【目的】 绝对生物利用度是血管外给药吸收进入体循环的药物的量,常以血管外给药的药物浓度曲线下面积(AUC)占静脉注射AUC的百分率表示。静脉注射后的血药浓度在快速下降的分布相,因分布未到达平衡,故而血药浓度不能反映体内的药物量。本文分析静脉注射后基于分布平衡后血药浓度AUC的绝对生物利用度计算方法,并与目前以实测血药浓度的AUC计算的绝对生物利用度进行比较。 【方法】 用药物分布房室模型和药物消除一级动力学的理论,分析静脉注射的不同时间点血药浓度与体内药物量的关系。在中国知网(CNKI)上以关键词“绝对生物利用度”检索1995年至2012年的文献,对有完整血药浓度-时间数据的文献进行分析。 【结果】 静脉注射后的分布相,体内药物的分布并未到达平衡,血药浓度不能代表体内的药物量。在分布平衡后,血药浓度的变化仅显示药物消除。将消除相血药对数浓度与时间进行直线回归,得回归直线的斜率和截距,计算出消除速率常数和分布平衡后零时的血药浓度。再将分布相的各时间点代入消除相的血药浓度-时间关系公式,计算分布相各时间点的血药浓度及AUC。此时的AUC模拟了分布平衡后分布相的AUC,加上消除相的AUC即为能反映静脉注射体内药物总量的AUC,进而计算绝对生物利用度。检索出有完整血药浓度-时间数据的绝对生物利用度文献29篇,其中二室模型10篇,将其血药浓度输入软件DSA 3.1.5,得消除相的截距、斜率β和血药浓度-时间关系直线方程。结果显示药物分布平衡后的C₀仅为文献方法C_max的1/4。将分布相的各时间点代入公式计算出各时间点的血药浓度,再用梯形法计算分布平衡后的AUC。文献方法的AUC是分布平衡AUC的(1.31±0.22)倍。常规法计算的绝对生物利用度是实际的(79±10)%。 【结论】 用静脉注射实测血药浓度AUC计算的绝对生物利用度明显低估了药物的吸收,应基于模拟分布平衡后的血药浓度计算绝对生物利用度。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,王放²,种晔³,彭一钊⁴,崔亚平⁴,余慧⁴;指导教师:曹永孝]]> 26true 【目的】 以前期杂种犬实验结果为参考,研究拥有自主知识产权的新型血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂普瑞巴肽(Z4A5)与依替巴肽、替罗非班经长时间静脉给药对比格犬血小板聚集、出血时间的影响,以及停药后血小板聚集功能恢复情况及作用特点。 【方法】 采用DAS软件进行重复拉丁方3×3随机设计,模拟临床给药方式采取负荷量与维持量连续给药,分3批实验。给药前、给药10、30、60 min和4、6、8 h及停药后不同时间点取血,采用比浊法测定测定血小板聚集,标准化出血时间测定器法,观察普瑞巴肽、依替巴肽、替罗非班对Beagle犬体内抗血小板聚集作用。结果采用SPSS 13.0软件进行拉丁方设计的三因素方差分析并行优效性检验。 【结果】 Z4A5组与依替巴肽组给药后对血小板聚集产生快速抑制作用;在持续给药期间对血小板聚集有稳定抑制作用,抑制率能达到临床血小板聚集目标抑制率(≥80%),与给药前相比有显著差别(P<0.05);停药后Z4A5对Beagle犬血小板聚集功能恢复快,血小板聚集恢复70%所需时间仅为依替巴肽组的1/8~1/16,明显优于依替巴肽组(P<0.05)。给药期间Z4A5组能延长出血时间达20 min以上,依替巴肽组能延长11~13 min,停药后Z4A5组出血时间的恢复快于依替巴肽组。 【结论】 普瑞巴肽抗血小板聚集作用优于临床批准剂量的替罗非班,停药后血小板聚集功能恢复明显优于依替巴肽和替罗非班,停药后Z4A5对出血时间延长作用的恢复明显优于阳性药物依替巴肽和替罗非班。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,黄蓝萱¹,时飞宇²,杨涛²,秦博文³;指导教师:王冰]]> 25true 【目的】 寻求高效低毒的内源性一氧化氮供体型前药,并探究其在生理条件下催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【方法】 采用常规法与微波法考察关键中间体制备条件;应用壳聚糖成膜策略耦联杂大环Cu(II)化合物,通过¹HNMR、¹³CNMR、SEM等手段对中间体及目标前药分子的结构和组成进行表征;利用重氮化反应探究其催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结果】 (1)探寻出关键中间体的高效、节能制备方法;(2)成功制备并表征了各中间体及其目标前药;(3) 制备的目标前药具有良好的催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结论】 为人工合成高效低毒的一氧化氮供体型前药的设计开辟了新思路,也为一氧化氮的供药方式提出了新的供药途径。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,宋文婷¹,余光勤¹,何顺莉¹,王双凤²,王清玉³;指导教师:袁泽利]]> 24true 【目的】 灌注固定是动物实验中的常规操作之一,但是灌注针脱落等是导致固定失败的主要原因,为此本创新设计制作灌注针的三维立体固定装置,以提高灌注成功率。 【方法】 本装置设计结构包括粗略调节和精细调节两个部分,精细调节部分借两侧的弧形臂与粗略调节部分相互连接,灌注针插入至精细调节部分的中央,其中粗略调节部分包括(1)夹持于动物操作台的侧向滑道,弧形臂一端借旋钮嵌入于滑道内,可前后方向移动至所需位置后旋钮旋转固定;(2)弧形臂以旋钮为中心可呈弧度旋转,调节上下方向并可靠旋钮固定到所需位置;(3)精细调节部分与两侧弧形臂的连接处有滑道,可左右方向移动至所需位置并借助旋钮固定。精细调节部分中心柱体穿过灌注针,(1)两侧以弧形小臂连接于粗略调节部分的弧形大臂滑道内;(2)柱体以环绕沟槽嵌入于以90度角度形成的两条弧形滑道内,弧形滑道两端以原位为基点可以做侧向的角度运动;(3)柱体在弧形滑道内位置移动实现不同角度的旋转;(4)柱体可旋钮固定终止角度运动;(5)精细调节部分的弧形滑道固定于圆环状基座内,环形孔中间有灌注针通过。未来设计中可加入以下部分:(1)麻醉后不进行解剖操作,立体定位后灌流针直接插入到左心室或主动脉;(2)立体定位后回流针插入右心房,灌注液流出实现即时收纳;(3)冲洗液和固定液定时定量灌入,自由掌控时间,减少操作,提高灌注效率。 【结果】 所设计的灌注针三维立体固定装置能够实现前后,上下和左右方向的粗略调节,继而通过精细调节部分也可实现对灌注针的角度和位置的细微控制,解决了灌注针位置移动脱落等难题。 【结论】 动物灌注三维立体固定装置能够通过上下、左右和前后三个维度的移动,将灌注针稳定于实验动物心脏和主动脉等插入位置,从而提高灌注成功率,能够为后续的免疫组织化学等实验奠定扎实基础。]]> 2014/12/11 10:03:28 23true 【目的】 解剖与观察海绵体神经的形成与走行,统计海绵体神经在重要位点的分支分型,测量其在重要位点的直径及其与盆腔参考标志的距离。为临床手术提供神经保护的安全操作范围,为海绵体神经的修复重建提供数据参考。 【方法】 对18例(34侧,左18,右16)甲醛液固定的成年男性盆腔标本进行解剖,观察前列腺丛、海绵体神经的走行与分支。利用圆规、游标卡尺测量海绵体神经起始部、穿盆部的外径以及与膀胱颈、前列腺尖和耻骨前列腺韧带等标志的距离。 【结果】 人海绵体神经自发出处至远端可分为三段:盆内段、穿盆段和盆外段。在起始部,海绵体神经以5~8支型由前列腺丛前下部的神经纤维渐次汇合形成,汇合后又以1~3支型神经纤维在前列腺的两侧向前走行至前列腺尖部。在距离前列腺尖部两侧3 mm处,海绵体神经以1~4支型神经纤维穿过尿生殖膈部,其穿盆点多位于前列腺尖的3~4点钟方向(右侧)和7~9点钟方向(左侧)。在盆外段,海绵体神经发散成丛,支配阴茎海绵体和尿道海绵体,并有小部分神经纤维与阴茎海绵体神经交通。海绵体神经的起始点距离膀胱颈(31.98 ± 4.65)mm,距离前列腺尖部(34.09 ± 7.88)mm;其穿盆点距离膀胱颈(38.45 ± 4.00)mm,距离耻骨前列腺韧带(33.83±4.58)mm。 【结论】 人海绵体神经的形成与走行较为复杂,解剖位置特殊,本研究首次对海绵体神经进行了定位、定量研究。通过大体解剖观测对海绵体神经进行了分段与分型;通过测量得到了海绵体神经重要部位的定位定量数据。为前列腺相关手术中进行神经保护操作提供了解剖学数据参考,给出了更清楚的安全操作范围。海绵体神经分型与直径的测量结果,给海绵体神经的修复重建提供了数据参考。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,郭晓丹²,黄会龙²,杨向群²;指导教师:杨向群]]> 22true 【目的】 评价头花蓼药渣饲养所得的蝇蛆作为动物饲料蛋白的安全性。 【方法】 选取80只小鼠随机分为4组,即对照组和高、中、低剂量组,每组各20只。高、中、低剂量组小鼠以药渣饲养获得蝇蛆(其含量分别为9%、7.5%、5%)替代常规饲料中蛋白成分,对照组小鼠采取常规饲料喂养,进行30 d喂养实验。实验期内观察小鼠的表观体征。实验结束后,取小鼠眼眶血进行血常规检查和血生化检测;进行解剖,取其心、肝、肾、脑、脾和胸腺称量,计算脏器系数;取小鼠肝、肾组织,制作H-E染色病理切片。 【结果】 药渣饲养所得蝇蛆喂养的各剂量组小鼠与对照组小鼠相比,其体重、呼吸、进食、活动情况均良好,增重量与食物利用率无显著性差异(P>0.05);血常规检查(淋巴细胞、血红细胞等)和血生化检测(肌酐、转氨酶等)所得数据间差异基本无显著性(P>0.05),脏器系数间无显著差异(P>0.05)。切片观察肝脏的肝小叶结构完整,肝细胞成多边形,核圆居中,无血管病变、萎缩、变性和坏死等改变;肾脏的肾小球与肾小管结构清晰,肾小管上皮细胞无变性坏死,肾小囊无粘连、狭窄等组织病变。 【结论】 该实验初步说明头花蓼药渣饲养所得的蝇蛆作为动物饲料蛋白安全、可行,为药渣的生物处理及动物饲料蛋白的开发提供新途径。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,张婉颖²,杨媛¹;指导教师:魏洪]]> 21true 【目的】 研究表明,移植用组织工程技术在体外构建工程心肌(engineered cardiac tissue, ECT)明显修复心泵功能。将心肌脱细胞处理制备出保留天然成分、超微结构和三维结构的心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM),能有效支持细胞的存活和生长,并影响其迁移和分化,可被用于构建仿生ECT。然而目前的脱细胞方法尚存在不足。本研究拟联合使用经典脱细胞试剂SDS和Triton X-100,改良脱细胞方法,制备性能更为优良的心肌ECM薄片,为构建仿生工程心肌片提共理想的生物支架。 【方法】 取6周龄成年昆明小白鼠心脏,经处理、包埋后沿横断面切成300 μm心室肌薄片,置于4℃无钙台氏液中保存。将切片分为正常对照组、SDS脱细胞组和改良脱细胞组。改良脱细胞组心肌片置于0.1%SDS中,37℃振荡反应11.5 h,去掉SDS,加入PBS漂洗3次,再加入0.5%Triton X-100,37℃振荡反应0.5 h。SDS组心室肌薄片按相同反应条件用0.1%SDS处理12 h。两组反应结束后,均加入PBS振荡漂洗3次,时间分别为10 min、30 min和1 h,以去除残余脱细胞试剂。正常对照组心室肌薄片置于含双抗的PBS中37℃振荡反应12 h。通过细胞成分定量(总RNA定量和总蛋白定量分析)、H-E染色和免疫荧光染色(胶原蛋白Ⅵ、层粘连蛋白和Heochst33247)评估脱细胞程度和ECM成分保留。将改良脱细胞组ECM与小鼠胚胎干细胞源心肌细胞(murine embryonic stem cell derived cardiomyocytes, mES-CMs)和小鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblasts, MEFs)共培养,通过动态观察和H-E染色的方法检测其生物相容性。 【结果】 SDS+Triton X-100改良脱细胞法能有效降低残留细胞成分含量;改良脱细胞法对核质去除较SDS脱细胞法更加彻底;改良脱细胞法更好地保留了胶原蛋白Ⅵ和层粘连蛋白两种ECM关键成分;改良脱细胞法制得的ECM能有效支持种子细胞生长和迁移。 【结论】 SDS+Triton X-100联合脱细胞法能更有效地去除细胞成分,并保护ECM中关键成分及其结构。制得的心肌ECM薄片具有良好的生物相容性。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,李文思¹,王璐²;指导教师:席姣娅]]> 20true 【目的】 应用基因遗传学实验技术,观察应用基因调控技术改变神经元兴奋性后,果蝇伤害性感觉神经元树突、轴突形态结构的变化,初步探讨兴奋性对神经元在发育过程中轴、树突形态结构及功能的影响。 【方法】 (1)应用单细胞基因调控技术Flip-out和MARCM,在果蝇胚胎及幼虫发育的不同时期通过过表达内向整流钾离子通道蛋白--Kir2.1,抑制单个神经元兴奋性;通过过表达钠离子通道蛋白——NaChBac或阳离子通道蛋白—dTrpA1,提高单个神经元兴奋性。(2)免疫组织化学方法对神经元轴、树突进行荧光染色后,应用激光共聚焦显微镜进行三维扫描,以获取神经元轴、树突的影像,通过三维图像分析软件Amira进行图像分析,从而确定抑制神经元兴奋性后其轴、树突形态结构的变化。(3)在体视显微镜下观察抑制伤害性感觉神经元后,果蝇三期幼虫爬行行为的改变,从而初步确定神经元形态结构与其功能的关系。 【结果】 (1)抑制单个神经元兴奋性后,其树突总长度明显增加,树突在皮肤表面的覆盖面积无明显变化;轴突末端结构单一化,细小分支明显减少,并有结节样结构出现,但轴突末梢主干长度无显著性减少,轴突末梢在中枢的投射偏向腹侧。(2)提高神经元兴奋性后,树突总覆盖面积明显减少,与邻近神经元之间出现明显分隔带;轴突末梢细小分支增加,在中枢的投射位置偏向背侧。(3)通过在不同发育阶段过表达Kir2.1,我们发现,兴奋性对神经元形态、结构及中枢投射的调节作用在三期幼虫早期之前均有效,但在三期幼虫中晚期改变神经元兴奋性则对神经元形态、结构及中枢投射无调节作用。 【结论】 神经元兴奋性对神经元形态及中枢投射的调节作用是从出生至二期幼虫时期,这一窗口时期是神经元兴奋性对神经元形态及中枢投射的关键时期。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,李蕊²,杨阳³,王瑶³,华锋³,李宏伟³,夏良锋⁴,钟司宇³;指导教师:杨利敏, 隋洪玉, 鲁彦]]> 19true 【目的】 为了提高医学生操作能力和补充实验教学的需要,利用局部解剖学实验后的头颅标本制成颅骨水平切标本。 【方法】 将局部解剖学实验后的头颅,去除附着在脑颅骨表面的肌肉及软组织,暴露脑颅骨,紧贴两侧眉弓上方、枕外隆凸上2~2.5 cm作一截面,沿此截面锯开颅骨,取出脑组织,剥离脑硬膜。于平舌骨下方将颈部锯开,使颅底与尸体分离。将颅盖和颅底放入不锈钢桶内,加10%碳酸钠溶液煮沸1~2 h,取出颅骨,剔除颅骨表面易除去的组织,摘下眼球,继续煮沸1~2 h,再次取出颅骨,分离出下颌骨、舌骨后剔除颅骨表面剩余组织。将颅骨放入加酶洗衣粉与洗洁精各5%混合液中先浸泡1 h,再煮沸1 h,去除眼眶及鼻腔内的软组织,再煮沸0.5 h,捞出颅底,剔除孔、裂、管处的组织。将颅骨置于流水下用钢丝球擦洗除鼻腔,眼眶外的颅骨表面残留的骨膜。颅骨置于流水下冲洗24 h后沥干。置于丙酮中脱脂,双氧水中漂白。在颞骨、下颌骨和枕骨打孔后,用弹簧、螺丝和线,连接下颌骨,颅盖和颅底,制成水平切颅骨标本。 【结果】 采用上述方法保证了舌骨、下颌骨、颅盖和颅底为同一个体,便于观察颅骨的整体观;翻开颅盖骨,可观察颅内面观的结构;暴露出的额窦,能使学生理解鼻旁窦的概念,解决了教学中的一个难点。 【结论】 整个操作方法简单易行,制成的标本美观,不易霉变,多方面满足了教学的需要;同时学生在标本制作过程中锻炼了思维,提升了动手能力,加深了对颅骨结构的掌握。]]> 2014/12/11 10:03:28 18true 【目的】 本课题的目标是应用N-甲基-N-亚硝脲(MNU)构建C57小鼠视网膜组织损伤的动物模型,并进一步观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对MNU诱导的视网膜损伤的治疗作用。 【方法】 本研究首先应用不同剂量的MNU腹腔注射给予C57小鼠,分别在注射后1、3、5、7 d等不同时间点,通过ERG、H-E染色等方法检测视网膜组织的功能及形态结构的变化,选择建立稳定的视网膜损伤动物模型的MNU最佳浓度及最佳观察时间点;在此模型的基础上,局部注射给予MSCs,采用ERG、H-E染色、TUNEL染色等方法观察MSCs对MNU诱导的视网膜损伤的治疗效果。 【结果】 (1)60 mg/kg剂量的MNU给药7 d后,ERG检测波幅明显降低(P<0.05),而75、90 mg/kg均呈现熄灭型波形,视网膜损害十分严重;45 mg/kg剂量的MNU即可引起视网膜形态轻微损伤(P<0.05),而60 mg/kg及其以上剂量的MNU可使视网膜厚度明显变薄,结构混乱,内外核层融合,损伤严重(P<0.001)。(2)60 mg/kg剂量的MNU作用后1 d开始,视网膜功能即出现明显降低;第3、7天均呈现逐渐下降趋势(P<0.01);60 mg/kg剂量的MNU作用后第3天,视网膜形态结构开始出现厚度变薄、细胞结构混乱、内外核层融合等损伤(P<0.01),第7天时,外核层仅有3~4层细胞,损害严重(P<0.001)。(3)60 mg/kg剂量的MNU作用1 d后给予玻璃体腔注射生理盐水,7 d后视网膜形态结构出现厚度变薄、细胞结构混乱、内外核层逐渐融合等损伤;60 mg/kg剂量的MNU作用1 d后给予玻璃体腔注射MSC 2.5x10⁴个细胞/μL(2 μL),则呈现出一定的治疗作用,即内外核层厚度趋于恢复,视网膜组织整体厚度增加(P<0.05)。 【结论】 (1)60 mg/kg剂量的MNU可引起视网膜功能及形态结构的严重损伤,以此可构建良好的视网膜损伤动物模型;(2)60 mg/kg剂量的MNU作用1 d开始,视网膜功能即出现明显降低;而从第3天开始,视网膜形态结构出现损伤;注射后7 d视网膜功能及形态均受到严重损害,即为建模的适宜观察时间点。(3)经玻璃体腔注射给予MSCs,对MNU诱导的视网膜组织损伤具有一定的治疗作用。]]> 2014/12/11 10:03:28 1,童钰鑫¹,尤昱斐¹,蔡曌²,王利婷²;指导教师:俞小瑞]]> 17true 【目的】 通过对腹前外侧群肌肌内神经分支分布的研究,为腹前外侧群肌肌移植的临床应用提供解剖学依据。 【方法】 改良的Sihler's肌内神经染色法:除色素, 固定好的标本用3%氢氧化钾进行浸泡5~6周;脱钙,标本用双蒸水冲洗后浸入Sihler's I液5~6周;染色,新配置的Sihler's II液对标本进行染色2~3周;脱色,标本放入 Sihler's I液脱染6~8 h,再用0.05% 碳酸锂中和1 h;透明,逐级甘油梯度(40%、60%、80%、100%) 透明,每一梯度约放2~3周。整个过程大约历时5~6个月。 【结果】 (1)腹外斜肌:受第7~12 胸神经前支支配;腹内斜肌和腹横肌:受第7~12 胸神经前支及第1腰神经前支支配;(2)支配该肌群的神经均从肌外侧入肌,神经走形与腹外斜肌纤维平行一致。 【结论】 腹前外侧群肌肌内神经呈节段性分布,相邻神经主干和分支之间均发出交通支形成不同程度的吻合。]]> 2014/12/11 10:03:28 16true 【目的】 探讨血清Cystain A、Cystain B的表达水平在甲胎蛋白(AFP)阴性或低表达(小于25 μg/L)原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)发生发展中的作用与临床意义,及其在PHC患者早期预测与筛查的应用价值。 【方法】 收集PHC患者(均通过术后或病理学确诊,PHC组)、肝硬化患者(肝硬化组)及正常门诊体检健康人(健康人组)各30例,各组AFP均为阴性或低表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中Cystain A、Cystain B含量,分析二者表达水平与PHC病理学特征的关系,结合临床症状、体征及影像学诊断来分析血清二者含量测定的灵敏度与吻合度;化学发光免疫法检测各组标本血清a-L-岩藻糖苷酶(AFU)、血清铁蛋白(SF)的含量,将Cystain A、Cystain B、AFU、SF按照各种不同组合方式进一步比较各组之间的灵敏度、特异度及准确度是否存在差异,筛选出一种或多种高灵敏度、高准确度的联合诊断模式。 【结果】 PHC患者血清中Cystain A、Cystain B的表达水平均明显高于肝硬化组和健康人组,差异具有显著的统计学意义(P<0.05),且具有较高的灵敏度和吻合度;Edmondson分级中Ⅰ~Ⅱ级PHC的Cystain A、Cystain B含量明显低于Ⅲ~Ⅳ级PHC(P<0.05),Cystain A、Cystain B含量高的PHC患者更易发生远处转移(P<0.05),但Cystain A、Cystain B二者之间没有明显差异;Cystain B与AFU联合早期诊断的灵敏度与准确度最高。 【结论】 AFP阴性或低表达(小于25 μg/L)的PHC患者血清Cystain A、Cystain B呈现高表达且与肿瘤组织分化等级、远处转移紧密相关,Cystain A、Cystain B在PHC发生发展中具有重要作用;Cystain B与AFU联合早期诊断可明显提高AFP阴性或低表达PHC患者血清的阳性检出率,提高确诊率,对AFP阴性或低表达PHC患者的早期预测与筛查有显著的应用价值。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,翁剑武²,苏钦坡²;指导教师:林扬元]]> 15true 【目的】 通过贴壁分离法、免疫磁珠分离法和流式细胞术分离法从人外周血获取单核细胞,比较细胞纯度、细胞得率以及实验成本和耗时,发现通过免疫磁珠法获得的单核细胞纯度高、得率高,实验成本较低、耗时短,为获取人外周血来源的单核细胞提供实验依据。 【方法】 单核细胞由骨髓中的多能造血干细胞、髓样干细胞分化而来,在骨髓中发育,并进入血液,停留2~3 d后迁移到周围组织中。单核细胞数量少,且独立的细胞株难以获得。那么在实验中如何获得足够数量,状态良好的单核细胞呢？单核细胞占外周血细胞的3%~8%,可从血液中分离获得。贴壁法、免疫磁珠法和流式细胞术法是分选单核细胞的经典方法,如何根据现有的实验条件,结合细胞纯度、细胞得率、实验成本、耗时四项指标选择最适合的一种实验方法呢？ 【结果】 我们发现,通过贴壁分离法,每获得2×10⁷个单核细胞细胞纯度18.8%,细胞得率5%,成本为500元,耗时6 h。通过免疫磁珠法,每获得2×10⁷个单核细胞细胞纯度80%,细胞得率11%,成本为1 500元,耗时6 h。而用流式细胞术分离细胞,每获得2×10⁷个单核细胞细胞纯度为73.4%,细胞得率7.5%,成本为2 100元,耗时10 h。综合分析细胞纯度、细胞得率以及实验成本和耗时,免疫磁珠法具有细胞纯度高、得率高,实验成本较低、耗时短的优点。 【结论】 因此,我们采用免疫磁珠法分离外周血单核细胞。]]> 2014/12/11 10:03:29 14true 【目的】 观察丙酮酸钠林格氏液对体外循环(CPB)患者转机不同时间点血液孵育后血液流变学的影响。 【方法】 CPB下行主动脉瓣或左房室瓣置换的患者13例(n=13)。分别于CPB转机前(T1)经桡动脉采血3 mL;转机10 min(T2)、60 min(T3)和停机60 min(T4)采血21 mL。在T1、T2、T3和T4时点各取3 mL血样,检测血液流变学基础值,T2、T3和T4各时点剩余血样18 mL平均分成6份(每份3 mL),随机分为对照组(C组)、丙酮酸钠林格氏液组(P组)、乳酸钠林格氏液组(L组),每组两份。C组各时点两份各加入生理盐水1 mL,在37℃下,一份孵育30 min、另一份孵育60 min后测血液流变学指标;P组加入丙酮酸钠林格氏液1 mL;L组加入乳酸钠林格氏液1 mL;其余处理同C组。 【结果】 (1)CPB转机过程对患者血液流变学指标的影响情况:①全血高切还原粘度(BHRV)、全血低切还原粘度(BLRV):与T1时点比较,T2时点BHRV、BLRV基础值均明显升高(P<0.05)。②红细胞聚集指数(EAI):与T1时点比较,T2时点EAI基础值升高(P<0.05)。③红细胞刚性指数(ERI)、红细胞变形指数(EDI):与T1时点比较,T2、T3时点ERI、EDI基础值均明显升高(P<0.05);(2)CPB转机后各时点三组液体孵育后血液流变学指标的变化情况:①BHRV:T2时点,P组孵育30 min后BHRV明显低于基础值,差异有统计学意义(P<0.05)。②EAI:T3时点,P组孵育30 min后EAI比基础值明显降低(P<0.05)。③红细胞电泳时间(EET):T2时点,P组孵育30 min后EET比基础值明显降低(P<0.05)。④ERI:T2时点,P组孵育30 min后ERI比基础值明显降低(P<0.05),P组孵育30、60 min后,ERI均明显低于孵育同时间的C组和L组(P<0.05)。⑤EDI:T2、T3时点,孵育30 min后,P组EDI值明显低于C、L组(P<0.05)。⑥其余血液流变学指标孵育前后均无明显变化(P>0.05)。 【结论】 (1)CPB转机对患者的血液流变学有不良影响。(2)丙酮酸钠林格氏液体外孵育CPB患者血液后对血液流变学有改善作用。]]> 2014/12/11 10:03:29 13true 【目的】 长久以来法医学界认为,若人生前没有摄入酒精,则死后血中乙醇浓度不应高于正丙醇浓度的20倍。然而,此结论是基于少量的案例讨论和血液的离体实验而得出的,一些实际案件也并不支持该结论。本实验旨在通过动物实验,统计分析大鼠腐败尸体血液中乙醇与正丙醇浓度水平之间的相关性,以研究乙醇与正丙醇的浓度比例能否作为判断生前是否饮酒的依据。 【方法】 分别对大鼠灌胃酒精或生理盐水,1.5 h后处死,放置于室内环境内。待其腐败后,取心血,并立即用气相色谱法检测其中乙醇及正丙醇浓度。 【结果】 生理盐水组(n=20)中有部分大鼠(n=6)血液中乙醇浓度高于正丙醇浓度的20倍;且在生理盐水组和酒精组中,均证实血液中乙醇浓度与正丙醇浓度之间并不存在相关性。 【结论】 我们认为血液中乙醇与正丙醇的浓度比例并不能作为判断死者生前是否摄入乙醇的依据。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,旷神怡²;指导教师:饶渝兰]]> 12true 【目的】 我国社区卫生服务主要针对社区内的个人和家庭提供“预防、医疗、保健 、康复、健康教育、计划生育技术指导”六位一体的基本公共卫生服务,其在卫生服务体系中发挥着越来越重要的作用。大力发展社区卫生服务,构建以社区卫生服务为基础、社区卫生服务机构与医院和预防保健机构分工合理、协作密切的新型城市卫生服务体系,对于坚持预防为主、防治结合的方针,优化城市卫生服务结构,方便群众就医,减轻费用负担,建立和谐医患关系,具有重要意义。 【方法】 社区卫生服务是一项复杂的、综合的医疗活动,应该从医方、患方、政府、媒体等多维度、多层次去理解和探讨,不能仅将研究视野局限在医务人员身上。笔者通过走访襄阳地区社区卫生服务中心,问卷调查,查阅文献资料,文献对比分析等方式对上述因素进行分析。 【结果】 现阶段我国社区卫生服务从总体上还存在诸多不完善的地方,这关系到广大人民的切身利益,制约着医疗卫生改革的进展。其不完善体现在以下几方面:政府不作为或作为力度不够,医务人员执行不力,患者自身认知上存在误区,媒体的不良导向。 【结论】 在医疗改革的大背景下,要想使社区卫生服务持续快速发展,必须从根本着手,充分发挥政府职能部门的功能,加大财政投入,解决人力财力短缺的问题。在此基础上,进一步完善各项规章制度,深化落实,加强监督管理,提高医务人员的素养,发挥媒体的正确导向作用,改善患者自身认知上存在误区,才能实现社区卫生服务的六位一体功能,继续推进医疗卫生事业的发展。]]> 2014/12/11 10:03:29 11true 【目的】 对襄阳市区空气、水质环境问题进行分析和评价,为襄阳市环境建设对策制定提供参考。 【方法】 收集襄阳市区空气、水质环境监督监测数据、文件、统计表等原始资料,对襄阳市区空气状况、汉江水域进行实地考察,分析襄阳市区空气质量和水质状况,评价2010-2012年襄阳市区空气、水质变化趋势、指标达标等。 【结果】 (1)空气质量 2010-2012年襄阳市区空气质量均为轻微污染,主要污染物为可吸入颗粒物。2012年、2011年优良天数比例较2010年略有下降;2012年襄阳市二氧化硫排放总量较2010年和2011年增加1.86倍和1.74倍,2012年和2011年工业排放二氧化硫占二氧化硫排放总量比例较2010年增加1.49倍和1.52倍,生活排放二氧化硫占二氧化硫总量比例较2010年减少2.1倍和2.2倍;2012年氮氧化物工业排放占总排放量比例较2011年降低,但机动车氮氧化物排放量占总排放量比例较2011年增加3.7%;2012年襄阳市工业烟粉尘排放量占总排放量比例较2011年增加2.4%,降尘量逐年增加。(2)水质质量 2010-2012年襄阳市汉江干流水质均为优;工业废水排放占废水排放总量比例逐年减少,城市生活污水排放比例逐年增加,集中式污染治理设施废水排放比例有增加趋势;工业化学需氧量占化学需氧量排放总量比例逐年降低;2012年、2011年废水氨氮排放较2010年明显增加,其中工业废水排放氨氮量较2010年明显减少,城市污水排放氨氮量增加;2012年废水中重金属排放量较2010年增加2倍,砷排放量增加8.4倍,石油排放量增加1.7倍;襄阳市城市内湖护城河的水质良,城市纳污河渠的南渠水质受到重度污染,为劣五类,主要为BOD5、氨氮、总磷、阴离子表面活性剂超标。 【结论】 (1)襄阳市区主要空气污染物为可吸入颗粒物,工业排放二氧化硫和机动车排放氮氧化物、工业烟粉尘和降尘逐年增加。(2)襄阳市汉江干流水质优,城市内湖水质符合国家标准,纳污河渠水质重度污染;生活污水和污染治理设施废水排放量、城市污水氨氮排放量、重金属、砷及石油的排放量逐年增加,工业废水化学需氧量及氨氮排放量逐年降低。]]> 2014/12/11 10:03:29 10true P>0.05)。【目的】 调查PCAD血瘀证患者相关危险因素及各亚型证特征。 【方法】 对322例PCAD患者进行临床流行病学调查,并应用秩和检验,logistic回归分析等方法对资料分析研究。 【结果】 (1)PCAD血瘀证存在明显的脂类代谢异常;PCAD血瘀证比晚发冠心病血瘀证存在更显著的脂类代谢和血流变异常;(2)BMI、吸烟、TG、LDL、高血压是PCAD血瘀证的危险因素;(3)PCAD血瘀证各亚型血瘀证积分,从高到低依次是痰浊血瘀证、气虚血瘀证、气滞血瘀证、阴虚血瘀证(P<0.05);(4)PCAD血瘀证各亚型中,0~1年病程以痰浊血瘀为主,2~5年病程以气滞血瘀居多,>5年病程以气虚,阴虚血瘀为主(P<0.01)。 【结论】 血瘀证存在明显的脂类代谢异常,且PCAD血瘀证比晚发冠心病血瘀证存在更显著的脂类代谢和血流变异常;BMI、吸烟、TG、LDL、高血压是PCAD血瘀证的危险因素。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,杨杨²,兰丽¹,张易²;指导教师:胡志希]]> 9true 【目的】 普通公民的急救知识与技能掌握程度,是衡量一个国家急救医疗体系发展和社会文明程度的重要标志。目前,我国北京、上海的心肺复苏知识普及率尚不足1%,远远落后于美、日等国(15%)和香港(10%);我国内地急救科普工作的最大障碍是人才的奇缺。为了研究将低年级医学生培养成为急救科普人才的可行性,本文以一年级医学生为对象进行了科普意愿的调查研究。 【方法】 参照红十字会的急救员培训与考试大纲,自行编制《生命救护知识与技能的学习和传播意愿调查问卷》,共有47个选择题;面向本校2013级《大学生现场救护》课程的438名学生进行问卷调查。 【结果】 共收回有效答卷403份(92.01%),其中男生130人(32.26%),女生273人(67.74%)。对答卷分析后发现:(1)既往有过各种意外受伤者累计达358人次(0.89次/人),既往有急、重病者累计达178人次(0.44次/人)。(2)从未学习过基本急救知识者352人(87.34%),入大学前学习过急救知识者(12.66%)中认为效果良好的仅占28.89%;积极主动选课和旁听者共计378人(93.80%),其中旁听者91人(22.58%),希望学习并经过技能考核后能获得急救员证书者344人(85.36%)。(3)在学习意愿方面,除电击伤和孕产妇急症救护2题略低于90%外,胸外心脏按压、人工呼吸和突发昏迷、心血管病急重症、溺水、急性哮喘、中毒、窒息以及动物咬蜇伤、骨折、长时间卡压伤等现场救护知识的比例均在92.30%以上;但在各专题的传播范围方面,选择家人、亲友者的比例介于33%~54%之间,选择家乡村民、居民者30%~45%(人工呼吸最低),选择母校师生和校友者9%~18%。 【结论】 医学院新生中既往意外受伤和急、重病的人均发生率很高,但是从未学习过急救知识的学生近90%;虽然一年级医学生学习生命救护知识与技能的兴趣很浓、意愿很强,但是他们大部分只想在家人和亲友中传播,较少的人愿意向乡邻传播,很少愿意回母校向师生和校友传播。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,毛光健¹,向勇²,吴莉萍¹,冯莘雅³;指导教师:孙国刚]]> 8true 【目的】 临床能力是医务工作者综合能力的重要体现,但目前医学院校实践性教学资源的普遍缺乏影响了医学生临床能力的培养。自上世纪末高校招生规模不断膨胀以来,许多二本类医学院的普教招生规模增长了数倍甚至10倍,医学生平均的实践性教学资源的匮乏不仅影响了医学教育和毕业生的质量,而且严重影响了医学生执业医师考试的通过率和从业就业的竞争实力。本项目研究了以社会实践活动去补充医学院校的实践性教学资源不足并促进医学生临床能力培养的可行性。 【方法】 首先,根据全球及我国本科医学教育人才培养的相关标准自行设计调查问卷及访谈提纲。其次,采取整群随机抽样的方法对本校五个年级的1 000名在校本科医学生进行问卷调查;同时采取访谈的方式对社会实践活动的组织者、参与者、受益人及医学专业课教师进行了访谈。第三,同参与过省级大学生急救知识科普项目的志愿者进行了专题研讨活动。 【结果】 回收有效答卷986份(有效回收率98.6%),访谈记录15份和专题研讨活动资料1套。将以上资料定量、定性分析后发现:第一,71.90%的医学生认为接触病人的机会少,限制了自己临床能力的培养;65.52%的医学生认为学校未能提供足够的实践机会和场所,以保障学生临床能力的培养。第二,80.34%的医学生认为可以通过社会实践促进自己临床能力的培养,64.13%的医学生希望参加同所学专业相关的医疗服务类社会实践活动。第三,100%的参与过省级大学生急救知识科普项目实践的医学生志愿者表示参与该活动后自己的临床能力有所提升。 【结论】 开展同临床医学专业知识相关的社会实践活动符合绝大多数医学生的愿望,这类社会实践活动对医学生临床能力的培养及促进作用得到了活动参与者、教师的高度认可,政府、社会和学校应该对开展促进医学生临床能力和综合素质培养的医学专业相关的健康教育类社会实践活动提供全方位、多角度的支持。]]> 2014/12/11 10:03:29 7true 【目的】 近年来,党中央、国务院一再强调学校要牢固树立“健康第一”的思想。本项目为了研究大学新生在中学阶段所掌握人体科学和健康素养常识的情况,以我校大一新生为研究对象进行了观察。 【方法】 项目组参照《中国公民健康素养66条》和美国中学核心教材《生命科学(人体)》(浙江科技出版社,2011)和人卫版教材《生理学》、《解剖学》等资料,自行编制《人体科学和健康素养常识的认知水平测试试卷》,共65个问题,其中人体科学常识问题40个(是非题30个,选择题10个),健康素养常识问题25个(是非题7个,选择题18个);面向本校529名大一新生进行书面测试,对收回的有效答卷进行统计分析。 【结果】 共收回有效答卷494份(93.38%),其中男生154人(31.17%),女生340人(68.83%)。根据答卷的正确率分析发现:(1)大一新生人体科学常识的平均正确率为53.69%(总正确率区间15.18%~87.65%,其中运动系统40.08%-87.65%、生殖系统18.83%~65.59%、心血管系统15.38%~55.26%、神经系统15.18%~25.91%、消化系统39.47%~67.81%、呼吸系统50.17%~80.36%);人体科学知识应用分析题的平均正确率为44.05%(总正确率区间21.86%~54.45%)。(2)大一新生关于健康素养常识的平均正确率为56.56%(总正确率区间31.17%~84.81%,其中健康生活方式部分37.04%~54.86%、健康膳食部分31.17%~58.09%、健康运动部分38.26%~53.44%、健康技能部分50.71%~84.81%)。(3)男女新生在健康素养常识上的平均正确率比人体科学常识高近3个百分点;男生在健康素养、人体科学常识上的平均正确率比女生分别高约3个、2个百分点。 【结论】 大一新生对人体科学和健康素养常识的总体认知水平不够高,特别是对神经、心血管和生殖等系统的人体常识总体认知水平很低,对健康素养的生活方式、膳食和运动等常识的总体认知水平也很低;高校新生在健康素养、人体科学常识认知水平上总体差异不大,男女生之间的认知水平差异也不大。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,陈思霖²,陈彬¹,张义琴¹;指导教师:聂业, 王家香]]> 6true 【目的】 项目组以本校2013级学生为观察对象进行了调查研究,以便明确男女生对医学知识的学习和传播动机上是否存在性别差异。 【方法】 参照红十字会的急救员培训与考试大纲,自行编制《生命救护知识与技能的学习和传播意愿调查问卷》,共有47个选择题;面向本校2013级公选课《大学生现场救护》的438名各专业学生进行问卷调查。 【结果】 共收回有效答卷403份(92.01%),其中男生130人(32.26%),女生273人(67.74%)。按性别统计分析答卷后发现:⑴男生中积极选修课程者99人(76.15%)、女生中则为188人(68.86%),男生高出7个百分点;女生中旁听者70人(25.64%)、男生中旁听者21人(16.14%),女生高出9.5个百分点;男、女生中希望获取急救员证书的比例均在85%左右。⑵男女生中选择各专题救护知识“非常愿意学习”的比例有差异,除了人工呼吸专题是男生高出女生11.5个百分点外,其余各专题按女生高出男生的百分点降序排列为:孕产妇急症25个点,重物卡(埋)压伤19个点,急性哮喘18个点,动物咬蜇伤15.5个点,电击伤13.5个点,突发昏迷救护13个点,急性窒息、伤口包扎、骨折救护等均为10个点,服毒和中毒救护9个点。⑶男女生中选择希望向非亲友的家乡村民、居民广泛传播的比例有所差异,女生高于男生9~12个百分点的专题知识有突发昏迷、服毒和中毒救护,女生高于男生5~6个百分点的有人工呼吸、动物咬蜇伤、伤口包扎和重物卡(埋)压伤员救护,女生高于男生但差别小于2个百分点的有孕产妇急症、电击伤、骨折、急性窒息和哮喘等。 【结论】 大学新生在学习现场救护专题知识并传播的意愿上存在一定的性别差异,在选课时男生的积极性高于女生,但参与旁听(无学分)的女生比例明显高于男生;同时,女生对于一半以上专题救护知识学习后广泛传播的愿望也高于男生。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,张义琴²,毛光健²,向勇³;指导教师:王建英, 孙国刚]]> 5true 【目的】 我校的医学本科毕业生答辩和科研导师制始于1990年,2005年起在低年级学生中推广科研导师制。本文以我校低年级学生为观察对象进行了调查研究,以便配合教育部2012年启动的“本科教学工程”大学生创新创业训练计划和落实好我校本科生创新学分管理的文件精神,促进低年级医学生参与创新创业活动。 【方法】 收集并分析2010年以来我校大学生创新创业项目的立项批文等资料;参照权威文献自行设计《大学生参与创新学习和科研活动的调查问卷》,共42个选择题,内容涉及参与科研活动的经历、意愿、制约因素及希望等;针对我校2013级的420名学生进行调查并对结果进行了统计分析。 【结果】 (1)分析我校2010-2013年度大学生科研项目立项资料表明,大一、大二学生所负责的项目数占当年立项总数的比例分别为2.63%、9.63%、14.96%、20.65%。(2)面向2013级的问卷调查共回收有效答卷403份(95.6%),其中不了解本校的大学生科研信息者占57.07%,参与过科研活动或申报过大学生创新创业项目者共占8.19%,从未参与过创新学习和科研活动者占81.63%,进入大学后查阅、借阅科技文献的次数平均少于1次/月者占85.85%;希望参与科研活动以培养自己的创新能力者占75.43%,希望在低年级得到科研培养并在三年级及以前获得立项资助者72.95%,希望平均每周参与科研活动0.5~2 d者占53.60%;认为自己在毕业前发表1篇以上科研论文、综述比较重要和非常重要者占89.08%,希望掌握科研方法、实验研究技能和仪器操作方法的学生占98.0%;希望学校提前3个月以上发布科研消息、提醒项目申报者者占33.00%,96.27%的学生希望学校能够为一年级开设科研活动课程、讲座和定期组织专题研讨会、创新学习论坛及学术报告会等。 【结论】 我校低年级本科生科研项目立项的比例还很低;大多数低年级医学生表示对大学生科研不够了解,缺乏参与创新学习、科研活动的经历和阅读科技文献的好习惯,但他们有良好的科研动机和执行项目的更多时间,并希望学校能面向新生开设科研课程、专题讲座、研讨型论坛及学术报告会等。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,周璐¹,李艾青²;指导教师:吴岩, 聂业]]> 4true 【目的】 了解延安市农村留守儿童心理健康状况,为留守儿童的心理干预提供参考。 【方法】 以延安是市宝塔区农村留守儿童为调查对象,采用整群抽样法,抽取延安市某乡镇留守儿童94名,采用《心理健康诊断测验》量表和《自信心量评估表》进行心理评估。 【结果】 延安市宝塔区农村留守儿童各因子均分在3.10~9.45,各因子≥8检出率在2.1%~66%,从高到低依次为:学习焦虑66%,身体症状17%,自责倾向14.9%,恐怖倾向5.3%,过敏倾向4.3%,对人焦虑2.1%,孤独倾向2.1%,冲动倾向2.1% 。自信心量表调查结果显示:总体均数为19.65±3.93,分数整体上处在12~24分之间占84.31%;13.73%的儿童分数在25~40之间;1.96%的儿童分数在11分以下,该部分儿童对自己显然不太有信心,过于谦虚和自我压抑,因此经常受人支配。 【结论】 延安市农村留守儿童无论在学习焦虑还是自信上,都存在有一定的问题,对农村留守儿童进行心理健康教育是非常必要的。]]> 2014/12/11 10:03:29 3true 【目的】 分析医患关系现状及其主要影响因素,为有效改善医患关系提供参考及依据。 【方法】 在陕西省四所三级医院中,随机抽取240名医生和600名患者,分别用自编的不同问卷(医者和患者各24个条目)对其进行医患关系现状认知的调查,采用SPSS19.0软件对数据进行分析。 【结果】 各种调查结果在医者和患者之间有差异(经?²检验,均为P<0.05), 65.1%的医生认为医患关系相对紧张,其主要社会因素为社会出现信任危机(占58.8%),医护人员的因素是医疗风险高(56%)及工作压力大(39%),患者方面的因素为受不良诱惑多,缺乏理性思考(占58.8%);74.1%的患者认为医患关系相对和谐,但看病贵、看病难(占43.8%)、医生水平不高(占41.7%)、医生服务态度不好(占34.7%)仍是影响医患关系的主要因素;71.0%的医生认为未来一段时期内医患关系的改善不太乐观,而71.7%的患者对其改善持乐观态度。 【结论】 调查显示,医者和患者在认知的诸多方面差异较大,应通过建立医患沟通渠道,媒体对医患关系客观全面的报道,医疗体制的改革及降低药价等措施,促进医患关系的改善。]]> 2014/12/11 10:03:29 2true 【目的】 在突发事故频繁发生的当前,面向校园乃至社会开展急救知识与技能的教育至关重要。只有让人们认识到掌握急救知识的重要性,真正学会自救与施救,才能一定程度减少突发事件的发生率及伤亡率。本研究旨在调研大、中、小学生的救护知识现状与需求,探索有效普及救护知识的模式与途径,为急救知识的普及培训提供帮助。 【方法】 通过向江西省南昌地区在校大、中、小学生各发放600份问卷来了解在校学生的急救知识水平,并由此制定三种不同的培训模式:(1)以急救动画视频教学为主,辅以现场示教等生动形式的模式;(2)以急救宣传册为主,辅以急救知识海报、黑板报等文字形式的模式;(3)以PPT讲座培训为主,辅以急救宣传册、培训室示教、网络教学等多形式相结合模式)。对各年龄的学生群体分别采用这三种模式进行急救知识宣传与培训,并对参加培训的学生进行考核,以判断培训效果,探索适合不同学生群体的急救知识培训体系。 【结果】 对比培训前后效果,大、中、小学生对急救的认识都有明显提高,其中以大学生提高最为显著,培训前后熟练掌握程度提高率为65%,中、小学生次之,提高率分别为58%和48%。 在各项急救知识技能中,地震等大事故逃生的提高率为74%,明显高于其他急救知识。其他急救知识技能的提高率依次为:中暑急救63%;外伤处理58%;烧烫伤、溺水47%;心肺复苏43%。通过比较不同培训模式的培训效果,对于小学生,模式一效果最为显著,其掌握程度平均提高率为64.5%,模式二、三的平均提高率为44.2%、35.4%;对于中学生,模式二培训效果最为显著,其掌握程度平均提高率为79.9%;模式一、三的平均提高率为47.2%、56.5%; 对于大学生,模式三培训效果最为显著,其掌握程度平均提高率为87.0%,模式一、二的平均提高率为50.2%、59.1%。 【结论】 面向社会人群普及应急训练刻不容缓,对不同学生群体急救培训模式应有其个性化特点。]]> 2014/12/11 10:03:29 1,朱滢¹,赵清²,聂睿志²,刘皓珩²;指导教师:郑莉萍]]> 1true