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| 【目的】 对野生型人IL-29受体结合区域的氨基酸残基进行定点改造,以期获得抗肿瘤活性更高的IL-29变异体。 【方法】 采用SWISS-MODEL网络服务器对IL-29与IL-28进行同源建模,再用Z-dock软件对IL-29与其受体结合亚基(IL-28R1)进行刚性蛋白质-蛋白质对接,然后用RosttaDOCK软件对获得的IL-29-受体复合物结构模型进行精细对接及优化。用PyMol软件分析确定IL-29肽链中与受体结合部位的关键氨基酸位点,然后以不同氨基酸进行置换和分子对接分析,用MM-PBSA法计算各位点氨基酸置换前后的结合自由能差(ΔΔG),选择ΔΔG差值大的氨基酸种类和位点为改造位点。设计定点突变引物,采用大引物PCR方法,将拟改变的氨基酸的编码碱基通过PCR扩增引入野生型IL-29基因进行置换,然后将获得的IL-29变异体基因插入质粒pPIC9K构建重组表达质粒,经测序鉴定后转化毕赤酵母进行发酵表达,发酵液经超滤浓缩和除盐后,采用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析纯化表达产物,用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析鉴定表达产物。将重组野生型IL-29、重组IL-29变异体设置高(1 000 ng/mL)、中(500 ng/mL)、低(50 ng/mL) 三个剂量组,分别对胃癌细胞SGC 7901、结肠癌细胞 HCT-8进行培养,同时设置空白对照和阴性对照组,以重组人IFNα2b药品为阳性对照组。用WST-8法检测各组样品对肿瘤细胞增殖的抑制率,统计分析各组样品对肿瘤细胞抑制效应的差异。 【结果】 经定点改造和重组表达及纯化,获得2个变异体IL-29 L (33Lys→33Arg单点突变体)和IL-29 Z (33Lys→33Arg、35Arg→35Lys双点突变体);WST-8法预试验结果显示,与阴性对照组比较,重组野生型IL-29高剂量组对胃癌细胞SGC 7901、结肠癌细胞 HCT-8的增殖抑制率分别为15.76% (P<0.05)、10.70% (P<0.05);重组变异体IL-29 Z高剂量组对SGC 7901的抑制率为52.17 (P<0.01),对HCT-8无明显抑制效应;重组IL-29 L 高剂量组对SGC 7901、HCT-8的抑制率分别为12.74% (P<0.05)、11.80% (P<0.05)。 【结论】 通过定点突变方法对人IL-29进行定点改造,可望获得抗肿瘤活性更高的IL-29变异体。 |
| 关键词: 人IL-29 定点突变 胃癌细胞 结肠癌细胞 增殖 抑制率 |
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