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| 【目的】 研究表明,移植用组织工程技术在体外构建工程心肌(engineered cardiac tissue, ECT)明显修复心泵功能。将心肌脱细胞处理制备出保留天然成分、超微结构和三维结构的心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM),能有效支持细胞的存活和生长,并影响其迁移和分化,可被用于构建仿生ECT。然而目前的脱细胞方法尚存在不足。本研究拟联合使用经典脱细胞试剂SDS和Triton X-100,改良脱细胞方法,制备性能更为优良的心肌ECM薄片,为构建仿生工程心肌片提共理想的生物支架。 【方法】 取6周龄成年昆明小白鼠心脏,经处理、包埋后沿横断面切成300 μm心室肌薄片,置于4℃无钙台氏液中保存。将切片分为正常对照组、SDS脱细胞组和改良脱细胞组。改良脱细胞组心肌片置于0.1%SDS中,37℃振荡反应11.5 h,去掉SDS,加入PBS漂洗3次,再加入0.5%Triton X-100,37℃振荡反应0.5 h。SDS组心室肌薄片按相同反应条件用0.1%SDS处理12 h。两组反应结束后,均加入PBS振荡漂洗3次,时间分别为10 min、30 min和1 h,以去除残余脱细胞试剂。正常对照组心室肌薄片置于含双抗的PBS中37℃振荡反应12 h。通过细胞成分定量(总RNA定量和总蛋白定量分析)、H-E染色和免疫荧光染色(胶原蛋白Ⅵ、层粘连蛋白和Heochst33247)评估脱细胞程度和ECM成分保留。将改良脱细胞组ECM与小鼠胚胎干细胞源心肌细胞(murine embryonic stem cell derived cardiomyocytes, mES-CMs)和小鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblasts, MEFs)共培养,通过动态观察和H-E染色的方法检测其生物相容性。 【结果】 SDS+Triton X-100改良脱细胞法能有效降低残留细胞成分含量;改良脱细胞法对核质去除较SDS脱细胞法更加彻底;改良脱细胞法更好地保留了胶原蛋白Ⅵ和层粘连蛋白两种ECM关键成分;改良脱细胞法制得的ECM能有效支持种子细胞生长和迁移。 【结论】 SDS+Triton X-100联合脱细胞法能更有效地去除细胞成分,并保护ECM中关键成分及其结构。制得的心肌ECM薄片具有良好的生物相容性。 |
| 关键词: 心肌ECM 脱细胞处理 |
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