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| 【立论依据】 脊髓损伤(SCI)是一种高致残率、高耗费的多发重症疾病。相比现有治疗方式,干细胞替代治疗前景广阔、效果更佳,且人源脂肪干细胞(hADSCs)取材容易、无免疫原性、无伦理争议,是临床治疗SCI引起神经功能丧失疾病的理想种子细胞。 【设计思路】 建立小鼠SCI模型,体外分离培养hADSCs,将其诱导分化为运动神经细胞(hADSCs-MN)并注入小鼠受损脊髓内;通过行为学评分(BMS)、动物电生理、组织病理学观察等方法追踪hADSCs或hADSCs-MN在损伤脊髓内的迁移去向、分化方向和功能整合情况。 【实验内容】 hADSCs的分离、纯化、培养并鉴定,体外诱导hADSCs为hADSCs-MN并鉴定,其中,hADSCs-MN用表达绿色荧光蛋白的慢病毒标记简称ANF,未诱导的hADSCs用相同慢病毒标记简称AF,hADSCs-MN用过表达Thymidine Kinase及mCherry荧光蛋白的单纯疱疹病毒标记简称ANH,未诱导的hADSCs用相同单纯疱疹病毒标记简称AH。C57雌鼠采用显微镜下钳夹法钳夹脊髓T9节段造模,术前1天及术后记录BMS评分直至处死,造模1周后分五组(分别为注射ANF、AF、ANH、AH的A、B、C、D实验组各10只和注射PBS的对照组10只)。细胞注射后第7周取每组部分小鼠注射Ganciclovir(杀死过表达Thymidine Kinase的ANH和AH组细胞),另取部分小鼠注射WGA和BDA,所有小鼠通过动物电生理检查神经传导通路恢复情况。细胞注射后第8周对所有小鼠进行灌注取脊髓,常规制片,通过WGA及BDA逆行、顺行神经示踪剂示踪外源细胞在损伤脊髓内的功能整合情况;通过用神经细胞标记物MAP2、GFAP及运动神经元标记物ChaT、HB9、Islet进行免疫组化观察脊髓生理状态及外源细胞在脊髓内的迁移去向、分化方向和功能整合情况。 【材料】 50只6周C57雌性小鼠;人源脂肪;诱导液;双抗;手术及显微外科器械;立体定向仪等。 【可行性】 相关文献已证实hADSCs具有多向分化潜能,可帮助恢复受损神经功能,Suelen等证实钳夹型SCI造模法可取,预实验手术成功率达94%。 【创新性】 采用模拟性强、稳定性好、精确性高的显微镜下钳夹法造模;巧妙设置多组对照,对hADSCs以及hADSCs-MN对SCI的治疗效果进行探究,为临床上SCI的治疗方案提供实验基础。 |
| 关键词: SCI 人源脂肪干细胞 诱导分化 |
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