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| 【立论依据】 TLR7激动剂是疫苗研发的理想佐剂,其抗肿瘤的作用表现为多效性,而肿瘤蛋白OCT4在生殖肿瘤中高度表达。更有研究表明,肿瘤免疫是以细胞免疫为主,而TLR配体与蛋白的偶联能产生更强的T细胞免疫效应。因此,本课题选择易合成及改造性强的小分子TLR7激动剂作为佐剂,首次将TLR7激动剂与OCT4蛋白偶联,有关研究已初步证实了偶联疫苗产生强而显著的抗肿瘤活性,具有临床应用价值。但是,OCT4在生殖细胞中亦高表达,该疫苗是否具有生殖细胞毒性尚需要进一步探明,为后续临床应用提供参考,此方面研究目前尚未见相关报道。 【设计思路】 用腹腔给药的方法研究体内生长发育成熟卵母细胞的超排情况,用液滴培养法研究3种试剂对体内发育体外成熟卵母细胞的情况,以及采用液滴包埋培养窦前卵泡模拟体外生长环境研究试剂对其体外发育成熟情况。 【实验内容】 选取雌性小鼠作为研究对象,分别采用体内超排、卵母细胞体外分段培养成熟技术检测TLR7、OCT4以及TLR7-OCT4作用后对卵母细胞数目、卵母细胞的成熟率以及体外培养卵泡直径与卵母细胞发育成熟状态的影响。 【材料】 实验动物:SPF级 KM小鼠;主要试剂:TLR7、OCT4、T7-OCT4、α-MEM培养基、注射用青霉素钠和硫酸链霉素、胎牛血清、矿物油、rLH、FSH、HCG及PMSG;实验仪器:二氧化碳培养箱、-80℃超低温冰箱、高压湿热灭菌锅、超净工作台、恒温水浴箱、倒置显微镜、正置显微镜等。 【可行性】 本实验室创立的生殖毒性检测系统现已完善,且各实验用品来源充足,窦前卵泡体外培养技术成熟。 【创新性】 实验材料价值大:OCT4控制细胞多能性的作用机制目前并未明确。本实验针对Oct4的作用特点研究其对女性生殖系统的影响,率先阐明Oct4在这一领域的具体作用价值;实验方法先进:率先将生殖工程中的前沿技术——腔前卵泡培养成熟技术应用于本实验的检测与评价中,高度接近人体生殖细胞的环境,该技术可靠性与准确性高;思路新:首次检测Oct4基因,腔前卵泡及卵母细胞发育,系统研究细胞毒性的发生过程及机制;意义深:在基因水平研究TLR激动剂对生殖系统的影响,从基因水平到具体性状,从微观水平到宏观水平,纵向剖析对生殖系统的具体影响,对生殖细胞的分化、生长、应激有着举足轻重的意义。 |
| 关键词: TLR7激动剂 OCT4 生殖 毒性 |
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