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| 【立论依据】 氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生和发展中起着关键性的作用。广泛存在于食品中的反式脂肪酸,能促进LDL的氧化修饰最终导致AS,有实验提示,反式脂肪酸是通过细胞膜上的脂质筏引起后续导致AS的各种反应,因此抗氧化治疗的维生素E等药物不能有效地阻止AS的发生。目前阻止体内LDL被氧化成为治疗AS的焦点,于是探究氧化LDL的分子机制变得至关重要。神经节苷脂(ganglioside,GM1)作为脂质筏的标志分子,已有研究显示其与LDL的氧化及分布密切相关,而其与LDL氧化的识别机制以及氧化环境的建立尚有待研究。 【设计思路】 本项目通过分析LDL诱导RAW264.7细胞前后,与神经节苷脂GM1特异结合的蛋白质向脂质筏的转位,从而找出介导LDL在微环境中进行氧化修饰的相关蛋白质因子。 【实验内容】 (1)细胞诱导和脂质筏分离:实验组,巨噬细胞RAW264.7与LDL共培养15 min;对照组,无LDL刺激;密度梯度离心分离脂质筏,非标记定量蛋白质组学鉴定产生的氧化应激相关蛋白。(2)细胞蛋白—GM1共沉淀:①收集巨噬细胞RAW264.7蛋白;②脂质体制备:实验组,制备原料加有GM1;对照组:原料不含GM1;③蛋白质-GM1结合:将收集的蛋白和制备的脂质体孵育结合,收集产物;④通过SDS-PAGE,质谱分析等找出与GM1特异结合的蛋白质分子。(3)蛋白质印迹法验证分析:分析步骤1和步骤2得到的共有蛋白,分别与LDL刺激细胞后分离的脂质筏成分以及与GM1特异结合的蛋白质进行蛋白质印迹法验证。 【材料】 RAW264.7细胞(武汉大学基础医学院);LDL( Pro Spec-Tany公司 );GM1(Sigma公司)。 【可行性】 预实验初步证实了LDL的氧化与脂质筏的形成有关;而且细胞膜“脂质筏”结构的主要组成成分糖鞘脂之一GM1参与了LDL的氧化,激光共聚焦显示GM1与LDL在RAW264.7细胞上的分布密切相关。 【创新性】 该项目首次证实了LDL与氧化微环境-脂质筏的形成有关,并寻找介导氧化的相关分子,从而进一步确认LDL氧化的具体机制。 |
| 关键词: 动脉粥样硬化 低密度脂蛋白 GM1 RAW264.7 脂质筏 |
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