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| 【立论依据及设计思路】 登革病毒的致病作用表现复杂,目前大多数学者均认同Halstead等于1977年提出的抗体依赖增强效应(ADE)学说。现已知与机体免疫应答有关的病毒蛋白包括E蛋白、M蛋白和NS1蛋白。其中,prM蛋白(即M蛋白的前体)的切割是未成熟登革病毒颗粒向成熟病毒颗粒转变的关键步骤。且prM蛋白为黄病毒属的主要表面抗原,能诱导机体产生特异性抗体,研究发现其亦与ADE作用相关。同行及我们的研究均发现 prM抗体是诱导ADE作用发生的主要增强型抗体。prM蛋白本身为糖蛋白,其糖基化位点存在于7、31、52上。目前对于prM蛋白各位点的糖基化作用及其机制不明,特别是其对ADE作用的影响尚无报道。因此,本实验通过构建单个和多个糖基化位点突变的真核表达载体,制备突变后prM抗体,探讨登革病毒prM蛋白N-糖基化位点7、31、52的单个和多个位点的突变重组对其ADE效应的影响。 【实验内容】 通过聚合酶链式反应(PCR)、突变体的设计与构建技术构建重组真核表达载体pPICZαA-prM,通过毕赤酵母表达系统稳定表达并纯化蛋白,免疫小鼠,制备鼠多克隆抗体。用分析型流式细胞仪和荧光定量PCR两种方法检测ADE效应。 【材料】 酵母表达质粒pPICZαA;菌株P. pastoris x33;实验小鼠;C6/36细胞株;LoVo 细胞株。 【可行性】 预期结果:(1)prM蛋白的各位点的糖基化都将对病毒的ADE效应有所影响,且糖基化位点越多,对ADE效应影响越大。(2)prM蛋白部分位点的糖基化将对病毒的ADE效应有所影响,且不同位点影响不同。(3)prM蛋白3个位点的糖基化对病毒的ADE效应都没有影响。 【创新性】 登革病毒是广泛流行于热带亚热带危害较大的虫媒病毒。人们对登革出血热和登革休克综合征机制未明确。其次,从蛋白糖基化角度研究探讨prM蛋白参与ADE效应的可能机制尚未见报道。本研究项目有助于进一步探讨DHF/DSS的发生机制,并能为新型登革热病毒疫苗与药物的研发提供新方向或者新思路。 |
| 关键词: 登革病毒 prM蛋白 糖基化 突变重组 prM多克隆抗体 抗体依赖性感染增强作用(ADE) |
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