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| 【立论依据】 胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。由于外科技术难以做到病理学上的全切除,术后复发率非常高。在前期实验中我们发现C6胶质瘤细胞miR-124含量显著低于与正常大鼠大脑组织,且转染miR-124 后,C6胶质瘤细胞数明显减少。我们应用microRNA靶基因信息软件查到smad4的mRNA与miR-124-3p有3个结合位点,smad4可能是miR-124的靶基因。由此推测miR-124可能通过抑制smad4的蛋白表达对胶质瘤细胞起作用。 【设计思路】 本实验以大鼠C6胶质瘤细胞为研究对象,通过人为转染miR-124,分析其对smad4蛋白表达的影响,并确定smad4为miR-124新靶基因,从而探索miR-124对促进C6胶质瘤细胞凋亡的新作用机制。 【实验内容】 (1)通过qRT-PCR检测正常大鼠大脑、C6胶质瘤细胞、转染后的C6胶质瘤细胞中miR-124的表达水平。(2)转染外源miR-124观察C6胶质瘤细胞的生长状态。(3)结合蛋白质印迹和TUNEL assay方法,比较分析miR-124转染前和后C6胶质瘤细胞凋亡差异。(4)通过qRT-PCR检测比较分析转染miR-124 前后C6胶质瘤细胞中smad4 mRNA的表达变化。(5)用蛋白质印迹检测转染miR-124前后的C6胶质瘤细胞中Smad4表达变化。(6)以siRNA-Smad4 抑制smad4基因的表达后,再转染 miR-124 mimic,通过蛋白质印迹和细胞荧光染色方法比较分析细胞增殖的变化。 【材料】 C6胶质瘤细胞,Lipo2000脂质体,miR-124 mimic,实时PCR仪,超净台,孵箱,相差显微镜,荧光显微镜,PCR相关试剂,蛋白质印迹相关试剂,TUNEL assay试剂盒,Smad4抗体等。 【可行性】 前期研究已证实人工转染miR-124后其细胞数明显降低,smad4的蛋白水平下调;通过microRNA靶基因信息软件查到smad4可能是miR-124的另一个靶基因;项目组成员已熟练掌握研究所需要各种实验技术;实验设备齐全,具有完成上述实验的基本仪器设备。 【创新性】 我们将证明:miR-124通过抑制smad4的蛋白表达,调控smad4,抑制胶质瘤细胞的增殖且促进死亡。已有研究表明miR-124通过抑制靶基因STAT3 的蛋白表达对胶质瘤起作用,但目前尚无关于miR-124与 smad4之间作用关系的报道。 |
| 关键词: miR-124 胶质瘤 smad4 凋亡 |
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