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| 【目的】 目前pMHC复合体(即MHC分子与抗原肽的复合体)常被用来检测特异性T细胞的数量,还是T细胞功能分析、抗原表位验证以及T细胞靶向治疗等诸多方面的有力工具。但是其制备技术复杂,复性、折叠和纯化等步骤受多种因素限制,产出效率较低。国内目前尚无生产厂家,一定程度上限制了我国基础与临床免疫学的更快发展。本实验旨在制备小鼠H-2Kb/OVA257-264复合体,验证其正确构象和与特异性T细胞TCR有效结合的功能,为在小鼠模型中进行移植排斥和肿瘤的生物治疗研究提供靶向工具。 【方法】 利用IPTG诱导编码小鼠H-2Kb蛋白重链的重组质粒和OVA-β2m 融合蛋白的重组质粒在大肠杆菌BL21中表达;通过超声粉碎、洗涤、化学纯化等方法收集两种重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度和分子大小;再经稀释复性法在体外折叠并超滤浓缩;利用尺寸排阻层析法在FPLC系统中纯化收集H-2Kb/OVA复合体,经BCA法蛋白定量后分装保存;通过包被细胞大小的PLGA微球,用H-2Kb分子构象特异性单抗进行荧光染色,经流式分析验证该复合体的空间构象;利用OVA抗原特异性的OT-1细胞株和流式细胞术分析检测该自制分子与TCR的结合能力。 【结果】 两种重组质粒在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析分子量同预计大小相等;复性、折叠、FPLC系统纯化洗脱后得到3个峰,其中第一个洗脱峰经SDS-PAGE鉴定证实含有重链蛋白和轻链蛋白,为H-2Kb/OVA复合体峰;流式荧光染色分析显示:该复合体包被PLGA后能与构象特异性抗体呈有效结合,提示构象正确;用该分子制备的PE-标记的H-2Kb/OVA四聚体染色OT-1转基因鼠的脾细胞,经流式检测:OT-1细胞占脾细胞群的16.35%。 【结论】 利用大肠杆菌成功表达了小鼠H-2Kb分子的重组重链和轻链,并经体外折叠和纯化成功制备了构象正确、能与特异性TCR结合的H-2Kb/OVA复合体。 |
| 关键词: MHC 小鼠H-2Kb/OVA复合体 折叠 纯化 FACS检测 |
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