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| 【目的】 针对当今社会越来越严重的假肉事件,建立一种快速、特异性强的基因鉴定方法,实现对猪、牛、羊、马、鸡、犬、鼠等常见肉类和加工熟食肉制品的鉴定。 【方法】 利用DNA条形码原理,用Genedoc软件多序列比对猪、牛、羊、马、鸡、犬以及鼠等常见肉源动物线粒体基因,寻找能够特异性区分各物种和亚种的基因片段。针对DNA序列,利用Primer Premier 6.0设计特异性引物,考虑到加工的熟肉制品DNA存在降解,引物设计时PCR产物大小限定在350 bp以下。随机混合2~3种肉类DNA,采用多重PCR方法扩增,检测引物的特异性。利用PCR方法,稀释DNA模板以10、1、0.1、0.01 ng进行PCR扩增,检测PCR的灵敏度。在羊肉中按10%、5%、1%比例混入猪肉,取100 mg混合肉,提取DNA并用猪肉引物进行PCR扩增,评价样品检测的灵敏度。以熟肉包、泡椒凤爪、香肠、牛肉粒、鸡肉派等深加工肉为原料,检测上述PCR方法的适用性。 【结果】 通过序列比对,选择线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)作为受检基因, COⅠ基因1 680~1 710 bp区域有极高的物种特异性,例如水牛和奶牛、山羊和绵羊在该DNA区域的差异碱基有5~7个。以该区域为PCR下游引物,分别针对每个物种设定上游引物,建立了七种动物源性成分的DNA条形码。DNA条形码区域为COⅠ基因1 200~1 710bp的序列,其中猪、水牛、山羊、马、鸡、犬、鼠7种动物的PCR产物大小分别为103、313、157、120、251、119和128 bp。对于大小接近的PCR产物,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测。结果表明利用COⅠ基因,通过混合模板、混合引物进行交叉PCR,均能特异性检测相应肉类。DNA模板的灵敏度可达0.01 ng,肉制品中1%的假肉(猪肉,1 mg)可被检出,熟肉的基因鉴定也是阳性。 【结论】 利用COⅠ基因1 200~1 710 bp区域,可以较好的区分不同肉类物种。该PCR方法特异性强、灵敏度高,所需检材微量,方法不受添加剂和高温加工等干扰,快捷准确,可作为肉制品中动物源性成分的鉴定方法进行推广。 |
| 关键词: DNA条形码 基因鉴定 PCR 假肉 |
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