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| 【目的】 探讨DNMT1和其特异性miRNA二者在Hcy致泡沫细胞形成过程中的作用,阐明特异性miRNA与DNMT1相互调控的分子机制。 【方法】 培养THP-1单核源性泡沫细胞,油红O染色鉴定;生物信息学预测调控DNMT1的特异性miRNA;运用qRT-PCR和Western Blot检测不同浓度Hcy(0、50、100、200、500 μmol/L)及100 mol/L Hcy+叶酸+维生素B12(H+F+V)干预泡沫细胞后,miR-148a和DNMT1的表达。使用慢病毒miR-148a mimic和inhibitor分别过表达和抑制miR-148a,检测其对DNMT1表达的影响;针对miR-148a与DNMT1特异性结合的碱基位点,构建野生型(Wt)和突变型(Mut)的3'UTR荧光素酶报告质粒,与miR-148a mimic共转染,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测DNMT1荧光素酶活性。采用胆固醇检测试剂盒分析miR-148a过表达或抑制后对细胞内胆固醇含量的影响。用100 mol/LHcy干预泡沫细胞,通过甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测miR-148a启动子区甲基化改变,同时构建DNMT1重组质粒并感染泡沫细胞,检测DNMT1过表达后miR-148a启动子区DNA甲基化变化。 【结果】 分析提示调控DNMT1的特异性miRNA为miR-148a;不同浓度Hcy干预泡沫细胞后,DNMT1表达降低,miR-148a表达升高,以100 μmol/L Hcy组改变最为明显,差异均有显著性(P<0.05);给予100 μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12后上述情况改善(P<0.05)。过表达miR-148a后DNMT1 mRNA和蛋白水平明显下降,而抑制miR-148a后DNMT1 mRNA和蛋白水平明显升高,差异均有显著性(P<0.05)。将WtDNMT1 3'UTR荧光素酶报告质粒与miR-148a共转染,荧光素酶活性显著下降(P<0.05);将MutDNMT1 3'UTR荧光素酶报告质粒与miR-148a共转染,荧光素酶活性无明显改变。提示miR-148a可能通过与DNMT1的mRNA 3'UTR碱基UGCACUG发生互补配对结合,从而靶向抑制其表达。过表达miR-148a后,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量明显增加;沉默miR-148a后,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量明显降低(P均<0.05);而细胞内胆固醇酯含量无明显变化。给予100 μmol/L Hcy干预泡沫细胞后,miR-148a甲基化呈显著下降趋势;给予叶酸+维生素B12干预后,miR-148a甲基化水平较Hcy显著升高(P均<0.05)。过表达DNMT1后,miR-148a启动子区DNA甲基化水平升高(P<0.05)。 【结论】 miR-148a是DNMT1的特异性miRNA,其可能通过直接与DNMT1 3'UTR部分碱基序列UGCACUG发生互补配对结合影响DNMT1表达;miR-148a可通过增加泡沫细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量参与Hcy致泡沫细胞的形成过程;DNMT1在miR-148a启动子区甲基化过程中发挥重要作用。 |
| 关键词: 关键词:MiR-148a DNMT1 同型半胱氨酸 泡沫细胞 |
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