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| 【目的】 我国是汉坦病毒所致肾综合征出血热发病情况最为严重的国家,作为传统预防措施的灭活疫苗在预防出血热发生中发挥了巨大的作用,然而仍存在免疫原性低,生产运输保存不便,免疫后机体不能获得长效免疫记忆能力等缺陷。为克服传统灭活疫苗的诸多不足,近年研究多集中在核酸疫苗的探索上。常规DNA疫苗表达的蛋白属内源性抗原,抗原提呈细胞(APC)启动MHCI类抗原加工途径,向CD8+T细胞提呈MHCI/抗原肽复合物,而CD4+T细胞不能被有效活化。溶酶体是外源性抗原加工途径MHCⅡ类分子器室(MⅡC)的重要组成部分。我们课题组利用溶酶体相关膜蛋白(LAMP)胞浆尾的靶向作用(可与内吞体/溶酶体膜结合并翻转其中),将汉坦病毒胞膜糖蛋白(Gn)基因插入LAMP分子luminal domain和transmembrane/cytoplasmic tail之间,使Gn直接进入MⅡC,从而实现内源性抗原的MHCⅠ类加工途径向MHCⅡ类加工途径的转化。由此,不仅可同时激活细胞免疫应答和体液免疫应答,还可获得较好的长效免疫记忆能力,保护机体免受汉坦病毒的感染和疾病的发生。 【方法】 构建质粒pVAX-Gn、pVAX-LAMP、pVAX-LAMP/Gn,转染293T细胞鉴定目的蛋白表达;高纯度去内毒素质粒免疫BALB/c小鼠,设立灭活疫苗对照组;通过间接ELISA和中和试验评价体液免疫应答;采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)与细胞杀伤试验共同评价特异性细胞免疫应答;夹心ELISA和实时定量PCR(qRT-PCR)检测攻毒后体内各组织病毒载量评价保护效力。 【结果】 成功构建载体并有效表达目的蛋白;实验组小鼠血清特异性抗体和中和抗体效价都明显高于各对照组,脾淋巴细胞特异性分泌IFN-γ和CTL杀伤活性亦均高于其他各组,体外结果表明:即使与传统灭活疫苗相比,特异性细胞与体液免疫应答均显著增强;体内攻毒试验显示,实验组小鼠体内无汉坦病毒特异性抗原检出,表明接种该疫苗可保护个体免受病毒感染;增强免疫观察到表位扩展,且仅在LAMP重组疫苗免疫小鼠组检测到长效记忆性免疫应答。 【结论】 汉坦病毒胞膜糖蛋白与人溶酶体相关膜蛋白嵌合基因疫苗能够获得良好的特异性免疫应答,同时具有很好的对抗病毒感染的保护效力和长效免疫记忆,这些都提示该新型汉坦病毒基因疫苗未来在临床上的应用前景。 |
| 关键词: 汉坦病毒 病毒糖蛋白 基因疫苗 溶酶体相关膜蛋白 靶向提呈 |
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