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| 【目的】 乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是原发性肝细胞癌(HCC)发生的重要因素,HBV的复制与表达受宿主肝细胞内多种转录因子调控,寻找宿主细胞内抑制HBV启动子活性的转录因子,将为实现控制HBV复制、阻断HCC发生提供重要理论依据。研究证实,新型转录抑制因子ZHX2能抑制肝癌重要标志物AFP和GPC3的表达,并通过抑制cyclinA/E启动子,在HCC发生中发挥抑癌作用。本室前期研究发现HCC组织中ZHX2表达与HBcAb相关,然而ZHX2是否抑制HBV转录迄今尚未报道。本研究旨在探索ZHX2对HBV基因启动子活性的调控作用及其分子机制。 【方法】 设计引物,以pcDNA3-HBV1.1质粒为模板PCR扩增获得HBV不同启动子片段,克隆入pGL3-Basic,构建HBV启动子报告基因表达载体。ZHX2过表达载体分别与HBV不同启动子报告基因表达载体共转染肝癌细胞系HepG2.2.15、BEL7402、HepG2细胞,双荧光素酶报告基因检测启动子活性变化;干扰NF-YA后检测启动子活性变化。在HepG2.2.15细胞过表达ZHX2,ELISA、RT-PCR、蛋白质印迹法检测HBV基因转录表达。 【结果】 成功构建HBV核心启动子(core promoter, CP)、前S1区启动子(SPI)、前S2及S区启动子(SPII)和X基因启动子(XP) 的报告基因表达载体pGL3-CP、pGL3-SPI、pGL3-SPII、pGL3-XP。4种载体在不同细胞中均表现出良好启动子活性(P<0.05)。共转染及双荧光素酶报告基因检测结果显示,HepG2.2.15细胞内ZHX2过表达可明显抑制CP、SPII、XP活性(P<0.01);干扰NF-YA可抑制SPII 活性(P<0.05),并消除了过表达ZHX2对SPII启动子的作用,提示ZHX2通过抑制NF-YA下调SPII活性。蛋白质印迹结果证实了ZHX2的过表达效果;与对照组相比,ZHX2过表达组actin水平基本一致,提示ZHX2并非通过影响细胞增殖而调节HBV转录。ELISA结果显示,ZHX2转染6 h 后细胞上清中的HBsAg、HBeAg显著降低 (P<0.05);RT-PCR结果发现,ZHX2转染48 h后明显降低HBV pgRNA表达,进一步证明ZHX2能抑制HBV基因的转录活性。 【结论】 ZHX2能抑制HBV CP、SPII、XP启动子活性,并抑制HBV pgRNA的合成,降低HBV抗原表达,提示ZHX2在HBV相关疾病防治中的潜在价值。 |
| 关键词: HBV 启动子 ZHX2 转录调控 |
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