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| 【目的】 白血病是一类造血系统恶性肿瘤,严重威胁人类健康。临床上可使用“注射用核糖核酸Ⅱ” 对白血病患者进行辅助治疗。该药是一种提取自牛胰腺的小分子RNA和多肽的混合物,但作用机制不清。本研究目的是通过miRNA芯片及生物信息学筛选,发现“注射用核糖核酸Ⅱ”中可能存在的具有抑制白血病细胞活性的miRNA,并研究其作用机制。 【方法】 应用microarray技术分析“注射用核糖核酸Ⅱ”药物中含有的人源miRNA。利用生物信息学技术和相关数据库预测其靶基因。通过Gene Ontology对靶基因进行功能富集。利用DAVID数据库进行KEGG信号转导通路富集分析进一步筛选出候选miRNA。利用CCK-8细胞活性检测试剂盒确定所选miRNA对白血病细胞生长的抑制作用。蛋白质印迹技术检测其相关靶蛋白的表达水平。用人外周血单个核细胞分离液分离CML及AML患者外周血白细胞并进行原代培养。CCK-8细胞活性检测试剂盒确定所筛选的miRNA对白血病原代细胞生长的抑制作用。 【结果】 应用microarray技术,从“注射用核糖核酸Ⅱ”药物中共检出23个人源miRNA。利用PicTar、miRanda和TargetScanS等数据库进行靶基因预测,筛选出了5个miRNA:miR-320a、let-7b、miR-Ⅱ、miR-494和miR-335。利用Cytoscape软件及其插件BiNGO对上述miRNA的靶基因进行了功能富集分析。DAVID工具进行了KEGG信号通路富集分析,最终选择了miR-Ⅱ进行进一步研究。miR-Ⅱ靶基因大多富集于转录因子调控、细胞凋亡、细胞增殖等信号通路。疾病信号通路主要富集于以慢性髓系白血病、急性髓系白血病、胰腺癌为代表的多种癌症,在各条信号通路中主要负责调控RAS、CyclinD、TGF-β等重要分子的表达。3种白血病细胞系(L1210、MEL和K562)体外实验显示,直接给予人工合成的miR-Ⅱ mimics自50 nmol/L起就可抑制白血病细胞活性,抑制率最高可达70%左右(300 nmol/L)且具有明显的剂量依赖效应。miR-Ⅱ对两种胰腺癌细胞系(PANC-1、AsPC-1)和一种正常细胞系(MDCK)无显著细胞毒性。AML(2位)、CML(1位)患者原代白血病细胞体外实验中,miR-Ⅱ具有一定的抑制白血病细胞活性的趋势。 【结论】 我们从microarray筛选获得的23种miRNA中,利用生物信息学方法确定出1种人源miRNA:miR-Ⅱ,体外实验证实miR-Ⅱ对多种白血病细胞系具有显著抑制作用,但对胰腺癌细胞系和正常细胞无明显细胞毒性。实验结果表明 miR-Ⅱ对原代白血病细胞具有一定的抑制细胞活性的趋势,具体作用机制有待进一步研究。本研究对治疗白血病miRNA的研发具有重要意义。 |
| 关键词: 白血病 miRNA 生物信息学 |
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