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| 【目的】 筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子,证实该蛋白与Wee1B的相互作用及作用机制,并进一步探讨其对小鼠受精卵早期发育的影响,本研究对揭示小鼠受精卵早期发育的分子机制和生殖机理具有十分重要的意义,为优化人类辅助生殖提供理论和实验依据。 【方法】 构建pGBKT7-Wee1B诱饵质粒并转入酵母感受态细胞中检测其对酵母的毒性、自激活能力以及表达情况,再将含有pGBKT7-Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定。经酵母重新转化验证后,在哺乳动物细胞中使用免疫共沉淀和免疫荧光共定位的方法确定候选分子与Wee1B蛋白激酶的相互作用。过表达或降低筛选分子,并显微注射入小鼠1-细胞期受精卵中观察Wee1B的蛋白激酶活性和定位的变化及候选分子是否通过Wee1B调控小鼠受精卵的早期发育。 【结果】 以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT野生型质粒为模板,设计特异性引物构建出pGBKT7-Wee1B诱饵质粒;诱饵质粒pGBKT7-Wee1B对酵母感受态细胞无毒性,无自激活能力,通过蛋白质印迹法验证其在酵母感受态细胞中表达;酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出了9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白;免疫共沉淀证实蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在HEK293细胞中存在相互作用;免疫荧光共定位确定蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在小鼠受精卵中共定位;干预KHDRBS3影响Wee1B的蛋白激酶活性和定位,并影响小鼠受精卵的早期发育。 【结论】 成功构建pGBKT7-Wee1B质粒,并以此为诱饵,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库筛选出KHDRBS3蛋白;免疫共沉淀证实KHDRBS3与Wee1B存在相互作用,且二者在小鼠1-细胞期受精卵中共定位。以上提示KHDRBS3蛋白可能通过调控Wee1B的蛋白激酶活性和定位进而参与小鼠受精卵的早期发育。 |
| 关键词: Wee1B KHDRBS3蛋白 酵母双杂交 免疫共沉淀 免疫荧光 小鼠受精卵 |
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